7 кл технология: Книга: «Технология. Сельскохозяйственный труд. 7 кл.Учебник для адаптированных осн. образоват. программ.ФГОС» — Евгения Ковалева. Купить книгу, читать рецензии | ISBN 978-5-09-042520-9

Содержание

7 класс. Тема: ТЕХНОЛОГИЯ. Культура производства

12.11.2020. Технология 7 класс. Тема: ТЕХНОЛОГИЯ. Культура производства.

Ф.И. ученика.____________________________________________________________

Культура объединяет в себе все материальные и духовные ценности, созданные человеческим сообществом. Это также принятая совокупность формальных и неформальных правил, норм, требований, которые должен соблюдать человек. Общая культура   включает в себя материальную и духовную культуру.

                                                                                                                                                                       Объектами материальной культуры являются орудия труда, средства производства, одежда, быт, жилище, средства сообщения- всё то, что является процессом и результатом  материальной деятельности человека, т.е. всё созданное техносферой.                                                                                                                                                                    К  духовной культуре относятся язык общения, знаки и символы,  накопленные знания, художественные произведения, моральные ценности, памятники литературы и искусства, архитектуры, религия, идеология, нормы и правила общения и поведения. Для создания материальных и духовных ценностей необходима  культура их производства. Культура производства включает в себя технологическую, информационную, графическую и экологическую культуру, а также культуру коммуникаций (общения) и культуру труда работников.                                                                                                                                                         Технологическая культура является основой производственной культуры.  Технологическая культура производства- это результат современных  научно-технических и социально- экономических достижений людей.  Её главными  показателями являются достижения современных  технологий, технических средств, качество продукта труда, экологичность производства. Информационная культура в производстве определяется видами применяемых форм отображения информации.                                                                                                           Графическая культура в производстве является частью информационной культуры.                                                     Коммуникационная культура в производстве – это система норм и правил организации взаимодействия людей в деловой сфере.                                                                                                                                                        Экологическая культура на производстве- это система  отношений, общественных и индивидуальных морально-этических норм, взглядов, установок и ценностей, касающихся взаимоотношений человека и природы. Культура труда работников производства выражается в методах, средствах и формах организации труда участников производства.

  Ответить на вопрос: Что такое культура? Что можно назвать культурой, а что нельзя? Где можно увидеть проявления культуры?

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Мосинжпроект участвовал в разработке 5 федеральных сводов правил по строительству подземных сооружений — Комплекс градостроительной политики и строительства города Москвы

Самые современные технологии подземного строительства и тоннелепроходки, обсуждаемые на конференции Тоннельной ассоциации России в рамках Международного форума строительной отрасли «100+ TechnoBuild 2021», используются при возведении новых станций и линий столичной подземки, сообщил генеральный директор АО «Мосинжпроект» Юрий Кравцов.

«Инжиниринговый холдинг «Мосинжпроект» – оператор программы развития московского метрополитена. На протяжении последних десятилетий мы выступаем управляющей компанией по строительству новых линий и станций метро. Работы ведутся по всему городу, в том числе, в плотной застройке его исторической части, в технически сложных и уникальных условиях», – сказал Юрий Кравцов.

По его словам, в этих условиях, а именно в связи с наличием в зоне строительства обилия инженерных коммуникаций, автотрасс, железных дорог, действующих объектов метро, чувствительных к вибрациям зданий, памятников истории и культуры, необходима минимизации воздействия на геоэкологическую среду.

Руководитель отдела научно-технического сопровождения строительства АО «Мосинжпроект» Дмитрий Конюхов пояснил, что компания разрабатывает, внедряет и применяет передовые технологии подземного строительства, обеспечивающие минимальное влияние на природно-техногенную городскую среду, интерактивные методы управления технологическими параметрами горно-строительных машин на основе результатов геотехнического мониторинга и инновационных методов управления геотехническими рисками.

«За последние 7 лет специалисты холдинга приняли участие в разработке пяти федеральных сводов правил по проектированию и строительству подземных сооружений. Кроме того, на всех этапах проходки тоннелей и строительства станций осуществляются их научное сопровождение, круглосуточный автоматизированный геодезический мониторинг, геофизические исследования состояния грунтового массива и контроль качества выполненных работ», – отметил Дмитрий Конюхов.

Начать просмотр

ВОПРОСЫ   #6

Как строят тоннели метро и что такое ТПМК

Тоннелепроходческий механизированный комплекс (также тоннелепроходческий щит, ТПМК) – машина для строительства тоннелей метро.

В 1930-е годы первые станции столичной подземки строились вручную: киркой и лопатой. Сегодня в арсенале метростроителей – передовые технологии. Для прокладки тоннелей используют автоматизированную сверхпрочную конструкцию под названием «проходческий щит». Ее можно сравнить со «стальным червем», который сверлит путь в толще породы, оставляя за собой готовый тоннель.

Назад

По легенде, изобретатель первого в мире проходческого щита англичанин Марк Брунель действительно придумал такую конструкцию после того, как во время службы во флоте пригляделся к «работе» корабельного червя. Он заметил, что голова моллюска покрыта жесткой раковиной, с помощью зазубренных краев которой червь буравил дерево, оставляя за собой на стенках хода гладкий защитный слой извести.

Идея машины оформилась в конструкцию в 1817 году, когда русский император Александр I обратился к Брунелю с просьбой спроектировать тоннель под Невой в Санкт-Петербурге. Правда, в России инженеру поработать не удалось – император решил возвести в намеченном месте мост. Однако в 1818 году первый щит Брунеля был запатентован, а в 1825-м с его помощью началось строительство тоннеля под Темзой.

Назад

В нашей стране проходческий щит впервые использовали в 1934 году для проходки сложного участка первой очереди московского метро между Театральной площадью и Лубянкой. А при строительстве второй очереди столичной подземки на трассах одновременно работало уже 42 щита – рекорд по объему используемой техники.

Московские строители первыми в мире с помощью тоннелепроходческих щитов стали прокладывать наклонные тоннели для эскалаторных зон. По заказу Мосметростроя канадская фирма Lovat разработала и изготовила ТПМК с наружным диаметром 11 метров. Именно с его использованием столичные метростроевцы впервые совершили щитовую проходку тоннеля для эскалаторов. Это произошло на станции «Марьина роща» Люблинско-Дмитровской линии метро.

Назад

Тоннели строятся в самых сложных инженерно-геологических условиях, и современные щиты рассчитаны на проходку в различных грунтах, в том числе в неустойчивых. Комплексы работают в два цикла: сначала разрабатывают грунт, затем возводят обделку, производя монтаж блоков. Средняя скорость проходки щитов сегодня составляет 250-300 метров в месяц.

Назад

Тоннелепроходческий комплекс – это целый завод по переработке грунта. В Москве всегда строили метро щитами диаметром 6 метров, теперь проходка ведется и 10-метровыми машинами-гигантами. 

Щиты – «десятки» используют при строительстве двухпутных тоннелей, где в одном тоннеле проходят пути встречных направлений, а платформы находятся по бокам.

Для обслуживания и эксплуатации одного большого щита требуется меньше оборудования для вывоза грунта, сокращается и количество сопутствующей инфраструктуры – это освещение, вентиляция, подвоз тюбингов.

Назад

Метростроители называют проходческие щиты женскими именами. Этот обычай появился благодаря Ричарду Ловату, основателю и владельцу известной канадской фирмы LOVAT, выпускающей ТПМК. Он решил, что все щиты компании должны носить женские имена в честь покровительницы подземных работ святой Барбары. Традиция распространилась и на машины других производителей. Сегодня московское метро строят «Татьяна», «Лилия», «Ольга», «Любовь», «Полина», «Софья», «Наталья»…

Назад

Как уточнил в ходе своего выступления руководитель отдела по механизированной проходке и специальным видам работ АО «Мосинжпроект» Николай Островский, при строительстве тоннелей компания применяет наиболее современные ТПМК диаметром 6 и 10 метров, последние предназначены для сооружения двухпутных тоннелей, что позволяет избежать возведения дополнительных конструкций и удешевить строительство, одновременно сделав метро безопаснее для пассажиров.

«Эффективность и безопасность строительства тоннелей также повышается за счет постоянного контроля технологических параметров работы тоннелепроходческих комплексов с использованием удаленного доступа к их визуализации в центре управления проходкой», – добавил Николай Островский.

По мнению экспертов компании, благодаря совокупности предпринимаемых мер и используемых технологических новшеств обеспечивается своевременный ввод протяженных участков столичной подземки. 

За последние десять лет с участием Мосинжпроекта в Москве построено и введено в эксплуатацию более 105 км линий и 51 станция метро, 11 электродепо. Большая кольцевая линия (БКЛ) метро – ключевой мегапроект в развитии столичной подземки. БКЛ будет включать 31 станцию, из которых 12 уже работают для пассажиров.

Начать просмотр

ВОПРОСЫ   #5

Большая кольцевая линия метро

Большая кольцевая линия Московского метрополитена – крупнейший в мире проект метростроения. Длина БКЛ составит 70 км с 31 станцией и тремя электродепо.

БКЛ может стать самой длинной кольцевой линией метро в мире, обогнав нынешнего «чемпиона» среди подземных колец – Вторую кольцевую линию Пекинского метро (57 км).

Первые идеи строительства БКЛ в Москве относятся к 1985 году. Но из-за недостатка ресурсов и других причин к реализации проекта не приступали в течение 25 лет. Решение начать строительство БКЛ принял мэр Москвы Сергей Собянин в 2011 году. Работы стартовали в ноябре того же года.

Назад

Большое кольцо соединит все радиальные ветки на расстоянии до 10 км от существующего кольца.

Со станций БКЛ можно будет сделать:

В ходе строительства БКЛ закладываются технические решения, которые позволят присоединить к ней новые радиусы метро:

Назад

На БКЛ запущены 12 станций метро.

Первые пять станций открыли в феврале 2018 года: «Деловой центр», «Шелепиха», «Хорошёвская», «ЦСКА» и «Петровский парк». Длина участка – 10,5 км. Его запуск улучшил транспортную ситуацию в четырех районах столицы: Хорошёвский, Аэропорт, Тимирязевский, Савёловский и в деловом центре «Москва-Сити».

В декабре 2018 года открылась «Савёловская», одна из самых глубоких и сложных в строительстве станций БКЛ: глубина заложения превышает 65 метров. Метро в шаговой доступности получили почти 240 тыс. жителей районов Беговой, Савёловский, Бутырский, Марьина Роща. Они могут без пересадок добраться от Савёловского вокзала до Новой Москвы (станция метро «Рассказовка»).

29 марта 2020 года открыли еще три станции БКЛ — «Авиамоторную», «Лефортово» и «Нижегородскую». Пока не будет полностью готов восточный радиус Большого кольца, они будут работать в составе Некрасовской линии.

Также в составе розовой линии метро действует открывшаяся в канун нового, 2021 года, «Электрозаводская».

Станции «Мнёвники» и «Народное Ополчение» открыты 1 апреля 2021 года.

Назад

Работы по проектированию и строительству развернуты на всех участках БКЛ.

Замкнуть кольцо планируется к 2022 году.

 

Назад

Вибропути. Поезда ходят по плите, «подвешенной» на вибропружинах. Когда на платформу подъезжает состав, пути амортизируют. Применение этой технологии практически нейтрализует вибрационное воздействие на здания, находящиеся на поверхности.

Колонны дымоудаления. В случае экстренной ситуации они «вытянут» дым с платформы.

Противопожарные «шторы». Так, на станции метро «Петровский парк» они спрятаны на «балконах» у перехода на зеленую ветку. Шторы выдвигаются, если на станции возникнет пожар или задымление. Они сделаны из специальной ткани, и в случае нештатной ситуации смогут отсечь открытые источники огня и не допустить распространения дыма.

Назад

Мосинжпроект представил модель развития городов «под ключ»

 

Мосинжпроект применяет передовую BIM-технологию

 

Мосинжпроект – лауреат премии ECO BEST AWARD

 

Мосинжпроект и проект «Притяжение»

HR-проект «Россети Ленэнерго» вошел в тройку лидеров на городском конкурсе «Лучшие кадровые технологии Санкт-Петербурга»

13.10.2021

HR-проект «Россети Ленэнерго» вошел в тройку лидеров на городском конкурсе «Лучшие кадровые технологии Санкт-Петербурга»

Новый кадровый проект ПАО «Россети Ленэнерго» — «Мастерская» — стал бронзовым призером ежегодного городского конкурса «Лучшие кадровые технологии Санкт-Петербурга», организованного Администрацией губернатора Северной столицы.

«Как правило, на должность мастера назначают крепкого «технаря», с релевантным образованием и достаточным опытом работы, но без управленческого опыта. Профессии «Мастер» не учат в университете, именно поэтому мы поставили перед собой амбициозную цель: применить комплексный подход к подготовке будущих мастеров и получить не только профессиональное развитие производственного персонала, но и развить управленческие компетенции», — отметила заместитель генерального директора ПАО «Россети Ленэнерго» Снежана Китаева.

Комплексная образовательная программа по развитию производственного персонала «Мастерская» разработана «Россети Ленэнерго» в этом году. Ее задача – сформировать кадровый резерв на должность мастера, подготовить молодых рабочих к управленческой деятельности и максимально популяризировать специальность мастера.

Проект ориентирован на развитие управленческих компетенций, повышение эффективности его участников и профессиональное обучение персонала по четырем направлениям: релейная защита и автоматика, кабельные линии, сетевое оборудование, оперативно-технологическое управление.

Программа уже апробирована на базе филиала «Россети Ленэнерго» — «Кабельная сеть». Ее участниками стали 37 молодых рабочих, ориентированных на профессиональное развитие и карьерный рост. В качестве преподавателей и тренеров были привлечены работники технического и HR блоков компании. Проект был реализован исключительно внутренними силами, благодаря чему удалось достичь эффекта синергии и создать развивающую среду для всех участников проекта.

По результатам реализации проекта 46 % участников получили новые компетенции и смогли продвинуться по карьерной лестнице.

В перспективе полученный успешный опыт планируется тиражировать и на остальные восемь филиалов «Россети Ленэнерго». Ориентировочный охват — не менее 280 работников компании. Данная практика может быть рекомендована внешним организациям для комплексной подготовки линейных руководителей без существенного отрыва от производства.

Проект «Мастерская» также вышел в полуфинал Всероссийского конкурса лучших практик подготовки кадров по номинации «Компетенции ХХI века: определение, развитие и оценка общих компетенций». Итоги конкурса будут подведены в ноябре.

***

Мастер – это руководитель среднего звена, линейный менеджер, который находится в постоянном контакте с рабочими и осуществляет непосредственное управление. Успешная работа коллектива во многом зависит от подготовленности мастера, его уверенности и мотивированности, психологической готовности к управлению.


плюрипотентных стволовых клеток | STEMCELL Technologies

Плюрипотентные стволовые клетки

Немногие области биологии в настоящее время привлекают больше внимания, чем изучение плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC). Этот интерес возник из-за того, что они могут стать основой клеточной терапии заболеваний, поражающих системы органов с ограниченной регенеративной способностью, предоставить усовершенствованные системы для скрининга лекарств и тестирования токсичности, а также получить представление о раннем развитии человека.В настоящее время существует два основных метода создания клеток с плюрипотентными свойствами. Первый включает выделение внутренней клеточной массы из ранней бластоцисты человека и культивирование полученных клеток в соответствующих условиях культивирования (см. Ниже) для создания эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК). 1 Второй включает искусственную экспрессию ключевых факторов транскрипции развития в типах соматических клеток, что при соответствующих условиях культивирования вызывает перепрограммирование клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). 2–4

Генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Много усилий было направлено на понимание состояния транскрипции недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток. Например, было показано, что OCT-3/4, 5 KLF-4, SOX2, 6 и NANOG 7,8 играют центральную роль в спецификации идентичности плюрипотентных стволовых клеток из-за их уникальных паттернов экспрессии и важные роли в раннем развитии. Эти усилия, наряду с другими, позволили открыть определенные факторы для перепрограммирования соматических клеток.Конкретные молекулярные процессы, с помощью которых соматические клетки перепрограммируются в плюрипотентные стволовые клетки, не изучены, хотя недавние открытия предполагают, что это ступенчатый процесс, 9,10 и что стохастический характер репрограммирования можно частично объяснить множеством молекулярных и генетические события, необходимые для полного перепрограммирования. 11 Текущие исследования направлены на повышение эффективности перепрограммирования за счет лучшего понимания нескольких переменных в процессе перепрограммирования: (1) выбор используемых факторов; (2) способы доставки; (3) тип клетки-мишени; (4) время и уровни экспрессии факторов; и (5) условия культивирования.В дополнение к этому также важны методы идентификации и характеристики действительно перепрограммированных плюрипотентных клеток. 12

Исходный коктейль факторов, описанный Yamanaka 13 , OCT4, SOX2, c-MYC и KLF-4, продолжает оставаться основными факторами, которые используются для перепрограммирования. Первоначально доставка факторов была достигнута за счет использования вирусов, интегрированных в геном. Однако опасения по поводу клинического использования этих клеток и возможности инсерционного мутагенеза привели к исследованию неинтегрирующих методов доставки факторов, включая временную трансфекцию, 14 неинтегрирующие вирусные подходы 15 и трансдукцию белков. 16 Другие недавние методы, такие как использование полицистронных миниколец, 17 синтетической мРНК, 18 самореплицирующейся РНК, 19 вирусов на основе РНК, таких как Sendai, 20 и синтетических микроРНК 21 , также были доказано, что он успешен. Особенно интересны недавние исследовательские усилия по выявлению небольших молекул, которые заменяют некоторые из этих факторов, либо изменяя паттерны метилирования генома, либо ингибируя ключевые пути передачи сигналов. 22,23 Конечная цель этого исследования — определить пошаговые протоколы, с помощью которых клетки могут быть полностью перепрограммированы исключительно химическими средствами.

Выбор типа клеток для репрограммирования основан на доступности образцов ткани, генетическом составе клеток-мишеней и эффективности репрограммирования. Кожные фибробласты кожи и клетки периферической крови являются наиболее часто используемыми типами клеток из-за ограниченной инвазивности сбора образцов и наличия накопленных образцов тканей, представляющих множество заболеваний. Типы клеток периферической крови обладают различной и часто взаимной эффективностью перепрограммирования по сравнению с частотой в крови.Например, гематопоэтический ствол и предшественники CD34 + обладают относительно высокой эффективностью репрограммирования 24 , но редко встречаются в циркулирующей крови (0,01-0,1%). 25 Напротив, Т- и В-клетки встречаются чаще и имеют приемлемую эффективность репрограммирования, 26 , но они менее идеальны в качестве клеток-мишеней для репрограммирования из-за перестроек генов TCR и IgG, которые могут влиять на нисходящую функцию hiPSCs, генерируемых из их. 27 Таким образом, периферическая кровь представляет собой многообещающий и легкодоступный источник клеток для репрограммирования.

Интересно, что не все типы клеток требуют доставки всех четырех факторов, чтобы успешно перепрограммировать клетки. Например, поскольку нервные стволовые клетки эндогенно экспрессируют SOX2, KLF-4 и c-MYC, они могут быть перепрограммированы исключительно посредством трансдукции OCT-4. 28 Типы клеток также обладают различной эффективностью перепрограммирования. У мышей клетки желудка и печени перепрограммируются более эффективно и полно, чем фибробласты. 29 Точно так же перепрограммирование адипоцитов человека примерно в 20 раз эффективнее, чем фибробластов, и имеет дополнительное преимущество, так как они являются легкодоступным источником клеток. 30,31 В качестве последнего соображения при выборе начального типа клеток в нескольких отчетах отмечается сохраняющаяся экспрессия генов из родительских типов клеток 32 , а также показано, что эпигенетическое состояние является предиктором исходного типа соматических клеток. 33 Такая эпигенетическая память может увеличивать склонность линий iPS-клеток к дифференцировке с исходной клеточной линией / типом. 33-35

Обычным явлением, наблюдаемым во время репрограммирования, является появление частично перепрограммированных колоний, которые обычно связаны с продолжающейся экспрессией факторов репрограммирования.Эти клетки проявляют ряд фенотипов, но часто не проходят тесты на полностью плюрипотентные клетки. 37 Chan et al. 38 показали, что хотя общая эффективность репрограммирования была ниже в условиях отсутствия питателя, единственными типами клеток, которые появлялись, были полностью перепрограммированные клетки. Это указывает на важность условий культивирования в процессе перепрограммирования. Мы разработали определенные и свободные от питателя среды для репрограммирования фибробластов (TeSR ™ -E7 ™) или клеток крови (ReproTeSR ™), которые обеспечивают узнаваемые колонии hiPSC с менее дифференцированным или частично перепрограммированным фоновым ростом клеток.

Условия культивирования для hPSC

Первоначальные методы культивирования hESC были смоделированы на основе методик, первоначально разработанных для культивирования мышиных ESCs (mESC). 39,40 Эти методы включали культивирование на слое митотически инактивированных эмбриональных фибробластов мыши (MEF или питающих клеток) в среде с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS). В этих условиях линии чЭСК могли размножаться бесконечно с сохранением своих плюрипотентных свойств. 1 На начальном этапе развития этих условий культивирования стало понятно, что дальнейшее использование кормушек и компонентов животного происхождения в культурах чЭСК будет препятствовать развитию клинических применений из-за: a) присутствия иммуногенного материала; б) риск передачи вируса животных или прионного материала; и c) трудности с контролем качества этих неопределенных компонентов.

Впоследствии улучшения этих процедур были в основном сосредоточены на удалении неопределенных и нечеловеческих компонентов.Несколько групп разработали условия культивирования чЭСК, которые в разной степени не содержат сыворотки и MEF. Было обнаружено, что в условиях, зависящих от MEF, сыворотка может быть заменена Knock-Out Serum Replacement, 41 коммерчески доступным заменителем сыворотки. Xu et al. сообщили о системе культивирования, в которой в качестве культуральной матрицы и MEF-кондиционированной среды использовался Matrigel® (состоящий из замещения сыворотки и основного фактора роста фибробластов, bFGF), что позволяло культивировать hESC без прямого контакта с питателями. 42 Другой подход к удалению MEF из системы культивирования заключался в замене их кормушками для людей. 43 Поскольку кормушки имеют человеческое происхождение, возможность передачи чужеродных патогенов ограничена, но, к сожалению, секретируемые факторы все еще не определены и могут сильно различаться между партиями.

Истинная культура без питателя была достигнута с использованием покрытия поверхности внеклеточного матрикса на посуде для культивирования и комбинации трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) и bFGF или высоких уровней одного только bFGF44,45 вместе с заменой сыворотки в среде. .В ряде публикаций описаны определенные составы сред, не содержащих ксено- или питателей, для поддержания чЭСК.46-49

Семейство TeSR ™ определенных и бессывороточных сред для культивирования hPSC без кормления включает mTeSR ™ 1, TeSR ™ 2 и TeSR ™ -E8 ™. mTeSR ™ 1 был разработан доктором Теннелем Людвигом и его коллегами из Исследовательского института WiCell ™ (Мэдисон, Висконсин) и поддерживает долгосрочное культивирование hESC и hiPSC без кормления. 49 Состав mTeSR ™ 1 включает ключевые факторы, которые поддерживают плюрипотентность, включая bFGF, TGF-β, γ-аминомасляную кислоту (ГАМК), пипеколиновую кислоту и хлорид лития, а также бычий сывороточный альбумин (BSA).mTeSR ™ 1 в настоящее время является наиболее широко публикуемым носителем без фидера, который используется в более чем 800 рецензируемых публикациях. TeSR ™ 2 — это более определенная среда, основанная на рецептуре, не содержащей ксенонов, из той же группы, содержащей рекомбинантный HSA. 47 Исследовательский институт WiCell ™ также разработал культуральную среду высокой четкости с низким содержанием белка для hPSC. Эта среда, TeSR ™ -E8 ™, содержит только самые важные компоненты, необходимые для обслуживания, обеспечивая более простую среду для культивирования плюрипотентных стволовых клеток.

hPSC отличаются на молекулярном и функциональном уровне от mESC и считаются более похожими на постимплантационные эпибластные стволовые клетки мыши (EpiSC). mESC и обычные hPSC демонстрируют различные паттерны экспрессии генов и разные требования в культуре. 50,51 В частности, mESC поддерживаются путем ингибирования передачи сигналов MEK / ERK, активации передачи сигналов WNT (посредством ингибирования GSK3) и стимуляции цитокином фактора ингибирования лейкемии (LIF), в то время как hPSC или мышиные EpiSC культивируются в FGF и активине и не реагируют на LIF. 50 Несколько недавних исследований выявили условия, способные поддерживать hPSC в «основном состоянии», напоминающем mESC, в отличие от «примированного состояния», в котором hPSC традиционно поддерживаются. 51-53

Много усилий было направлено на поиск матриц поверхностей, более определенных, чем Matrigel®. Двумя наиболее многообещающими подходами являются синтетические пептиды, химически связанные с культуральным оборудованием, 54,55 и рекомбинантные белки, которые взаимодействуют со специфическими интегринами и молекулами клеточной адгезии. 56,57 Новая определенная поверхность Vitronectin XF ™ была разработана и произведена Primorigen Biosciences и коммерчески выпущена компанией STEMCELL Technologies. Vitronectin XF ™ можно использовать с mTeSR ™ 1 или TeSR ™ 2 или TeSR ™ -E8 ™ для системы культивирования, не содержащей ксенонов.

Клиническое применение чПСК

Ожидается, что из-за их способности к дифференцировке hPSC могут лечь в основу клеточной терапии, когда повреждение или нарушение функции ткани является серьезным и необратимым.Сердечно-сосудистые заболевания, диабет 1 типа, травмы спинного мозга и болезнь Паркинсона являются примерами заболеваний, от которых можно надеяться, что лечение на основе hPSC станет возможным. Были разработаны методы дифференциации чПСК на различные типы взрослых клеток, включая гемопоэтические, 58-60 сердечные, 61,62 нервные, 63-65 панкреатические, 66-71 пигментированный эпителий сетчатки 72,73 и остеогенные линии. 74 Однако ряд препятствий в настоящее время препятствует клиническому применению методов лечения на основе чПСК.В настоящее время проведено только ограниченное тестирование клеток, полученных из hPSC, чтобы гарантировать полное созревание и функциональность дифференцированных клеток. Кроме того, протоколы дифференцировки hPSC в функционально релевантное потомство, как правило, неэффективны, что приводит к низкому выходу дифференцированных клеток и загрязнению другими типами клеток в результате аберрантной дифференцировки. Большую озабоченность вызывает возможность сохранения недифференцированных hPSC в пересаженных популяциях, что может привести к тератомам. 75,76

Дальнейшие опасения связаны с возможностью иммунного отторжения трансплантированных клеток либо из-за экспрессии различных антигенов главного комплекса гистосовместимости на донорских клетках 77 , либо из-за экспрессии чужеродных антигенов в результате культивирования в продуктах животного происхождения. 78 Использование индивидуальных ИПСК для клеточной терапии позволит обойтись без согласования гистосовместимости. И хотя возможность отторжения из-за чужеродных животных антигенов остается спорной, 78,79 прилагаются большие усилия для разработки культуральных сред и матриц, свободных от ксенонов, для размножения и дифференцировки hPSC.STEMCELL Technologies предлагает набор STEMdiff ™ определенных и не требующих кормления продуктов для эффективной дифференцировки hPSC в клетки всех трех линий.

Клиническое применение методов лечения на основе hPSC приближается к реальности. Например, группа под руководством доктора Масайо Такахаши из RIKEN, Япония, недавно начала лечение первых пациентов с возрастной дегенерацией желтого пятна с использованием аутологичных пигментированных эпителиальных клеток сетчатки, полученных из hiPSC. Аналогичным образом в США продолжаются ранние клинические испытания.S. и E.U. от Advanced Cell Technologies, чтобы использовать полученные из чЭСК пигментированные эпителиальные клетки сетчатки для лечения макулярной дистрофии Старгарта, дегенеративного заболевания глаз, которое вызывает слепоту у детей. Наконец, ViaCyte недавно получила одобрение FDA от IND в качестве кандидата на заместительную терапию бета-клетками на основе hESC для лечения диабета 1 типа и скоро начнет первую фазу клинических испытаний.

Использование hPSC в скрининге лекарственных средств и токсикологическом тестировании

Наиболее немедленный эффект может быть получен от использования hPSC в области разработки лекарств или тестирования токсичности.Было подсчитано, что стоимость вывода нового препарата на рынок посредством разработки, клинических испытаний и утверждения FDA может составить от 800 миллионов до 1,3 миллиарда долларов США. 80 Кроме того, количество лекарств, которые в конечном итоге оказываются успешными, очень мало, и многие лекарства не работают на стадиях клинических испытаний фазы II или III из-за неожиданной токсичности после того, как в их разработку были вложены большие средства. Учитывая эти затраты и высокий риск, который берут на себя фармацевтические компании, наличие доступа к большому количеству биологически значимых клеток человека для раннего тестирования и скрининга дает большие преимущества.hPSC в их недифференцированном состоянии могут быть полезны для выявления тератогенных или токсических эффектов потенциальных соединений. Включение соединений в определенные протоколы дифференцировки может идентифицировать кандидатов, которые усиливают или искажают дифференцировку в сторону благоприятного результата. Возможность генерировать большое количество клеток конечной стадии, таких как нейроны и кардиомиоциты, в конечном итоге обеспечит непосредственно релевантные типы клеток для лекарств, разрабатываемых для сердечно-сосудистых или нейродегенеративных расстройств. Кроме того, образование кардиомиоцитов и гепатоцитов может иметь прямое отношение к измерениям токсичности.Наконец, ИПСК, специфичные для заболевания, полученные путем перепрограммирования соответствующих типов клеток пациентов, могут выявлять не только фундаментальные биологические дефекты, но и предоставлять потенциально неограниченное количество клеток, с помощью которых можно исследовать потенциальные терапевтические подходы.

Список литературы

  1. Thomson JA, et al. Наука 282 (5391): 1145–7, 1998
  2. Takahashi K, et al. Ячейка 131 (5): 861–72, 2007
  3. Yu J, et al. Наука 318 (5858): 1917–20, 2007
  4. Park I-H и др.Nature 451 (7175): 141–6, 2008
  5. Nichols J, et al. Cell 95 (3): 379–91, 1998
  6. Avilion AA и др. Genes Dev 17 (1): 126–40, 2003
  7. Chambers I, et al. Ячейка 113 (5): 643–55, 2003
  8. Mitsui K, et al. Cell 113 (5): 631–42, 2003
  9. O’Malley J, et al. Nature 499 (7456): 88–91, 2013
  10. Дэвид Л. и Поло Дж. М.. Исследование стволовых клеток 12 (3): 754–61, 2014
  11. Buganim Y, et al. Ячейка 150 (6): 1209-22, 2012
  12. Махерали Н. и Хочедлингер К.Стволовые клетки клетки 3 (6): 595–605, 2008
  13. Такахаши К. и Яманака С. Cell 126 (4): 663–76, 2006
  14. Okita K, et al. Наука 322 (5903): 949–53, 2008
  15. Woltjen K, et al. Nature 458 (7239): 766–70, 2009
  16. Zhou H, et al. Стволовые клетки клетки 4 (5): 381–4, 2009
  17. Jia F, et al. Nat Методы 7 (3): 197–9, 2010
  18. Warren L, et al. Стволовые клетки клеток 7 (5): 618–30, 2010
  19. Йошиока Н. и др.Стволовые клетки клетки 13 (2): 246-54, 2013
  20. Nishimura K, et al. J Biol Chem 286 (6): 4760–71, 2011
  21. Miyoshi N, et al. Стволовые клетки клетки 8 (6): 633–8, 2011
  22. Lin T, et al. Нат методы 6 (11): 805-8, 2009
  23. Hou P, et al. Наука 341 (6146): 651-4, 2013
  24. Mack AA, et al. PLoS One 6 (11): e27956, 2011
  25. Sutherland DR, et al. Exp Hematol 22 (10): 1003-10, 1994
  26. .
  27. Nishimura T, et al.Стволовые клетки клетки 12 (1): 114–26, 2013
  28. Serwold T, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 107 (44): 18939–43, 2010
  29. Kim JB и др. Nature 461 (7264): 649–3, 2009
  30. Aoi T, et al. Наука 321 (5889): 699–702, 2008
  31. Sun N, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 106 (37): 15720–5, 2009
  32. Sugii S, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 107 (8): 3558–63, 2010
  33. Marchetto MCN, et al. PLoS One 4 (9): e7076, 2009
  34. Ким К. и др.Nature 467 (7313): 285–90, 2010
  35. Xu H, et al. Cell Res 22 (1): 142–54, 2012
  36. Hu Q, et al. Стволовые клетки 28 (11): 1981–91, 2010
  37. Ким К. и др. Nat Biotechnol 29 (12): 1117–9, 2011
  38. Stadtfeld M и Hochedlinger K. Genes Dev 24 (20): 2239–63, 2010
  39. Chan EM, et al. Nat Biotechnol 27 (11): 1033–7, 2009
  40. Мартин ГР. Proc Natl Acad Sci U S. A 78 (12): 7634–8, 1981
  41. .
  42. Эванс MJ и Кауфман MH.Nature 292 (5819): 154–6, 1981
  43. .
  44. Vierbuchen T, et al. Nature 463 (7284): 1035–41, 2010
  45. Amit M, et al. Дев Биол 227 (2): 271-8, 2000
  46. Hovatta O, et al. Hum Reprod 18 (7): 1404–9, 2003
  47. Amit M, et al. Биол Репрод 70 (3): 837–45, 2004
  48. Levenstein ME, et al. Стволовые клетки 24 (3): 568–74, 2006
  49. Vallier L, et al. J Cell Sci 118 (19): 4495–509, 2005
  50. Лу Дж. И др. Proc Natl Acad Sci U S A 103 (15): 5688–93, 2006
  51. Yao S, et al.Proc Natl Acad Sci U S A 103 (18): 6907–12, 2006
  52. Ludwig TE, et al. Nat Methods 3 (8): 637–46, 2006
  53. Николс Дж. И Смит А. Колд-Спринг-Харб Perspect Biol 4 (8): a008128, 2012
  54. Takashima Y, et al. Ячейка 158 (6): 1254–1269, 2014
  55. Gafni O, et al. Nature 504 (7479): 282–6, 2013
  56. Theunissen TW, et al. Стволовые клетки клетки 15 (4): 471–487, 2014
  57. Melkoumian Z, et al. Nat Biotechnol 28 (6): 606–10, 2010
  58. Villa-Diaz LG, et al.Nat Biotechnol 28 (6): 581–3, 2010
  59. Rodin S, et al. Nat Biotechnol 28 (6): 611–5, 2010
  60. Nagaoka M, et al. PLoS One e15, 2006
  61. Chadwick K, et al. Кровь 102 (3): 906–15, 2003
  62. Menendez P, et al. Mol Ther 10 (6): 1109–20, 2004
  63. Wang L, et al. Кровь 105 (12): 4598–603, 2005
  64. Dai W, et al. J Mol Cell Cardiol 43 (4): 504–16, 2007
  65. Laflamme MA, et al. Nat Biotechnol 25 (9): 1015–24, 2007
  66. Zhang SC, et al.Nat Biotechnol 19 (12): 1129–33, 2001
  67. Elkabetz Y, et al. Genes Dev 22 (2): 152–65, 2008
  68. Chambers SM, et al. Nat Biotechnol 27 (3): 275–80, 2009
  69. Rezania A, et al. Nat Biotechnol 32 (11): 1121-33, 2014
  70. Pagliuca FW, et al. Ячейка 159 (2): 428–439, 2014
  71. Rezania A, et al. Стволовые клетки 31 (11): 2432–42, 2013
  72. Rezania A, et al. Диабет 61 (8): 2016–29, 2012
  73. Scholbach J, et al.PLoS One 7 (10): e46772, 2012
  74. Kroon E, et al. Nat Biotechnol 26 (4): 443–52, 2008
  75. Osakada F, et al. Nat Biotechnol 26 (2): 215–24, 2008
  76. Idelson M, et al. Стволовые клетки клетки 5 (4): 396–408, 2009
  77. Karp JM, et al. Стволовые клетки 24 (4): 835–43, 2006
  78. Bjorklund LM, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 99 (4): 2344–9, 2002
  79. .
  80. Fujikawa T, et al. Am J Pathol 166 (6): 1781–91, 2005
  81. Swijnenburg R-J, et al.Тираж 112 (9 доп.): I166–72, 2005
  82. .
  83. Martin MJ, et al. Nat Med 11 (2): 228–32, 2005
  84. Cerdan C, et al. Nat Med 12 (10): 1113–4; ответ автора 1115, 2006
  85. Munos B. Nat Rev Drug Discov 8 (12): 959–68, 2009

Плюсы и минусы | Стволовые клетки

Плюсы и минусы использования различных стволовых клеток

  • Можно использовать обильные соматические клетки донора
  • Проблем гистосовместимости с трансплантатами донора / реципиента можно избежать
  • Очень полезно для разработки лекарств и исследований развития

Стволовые клетки взрослых

Эмбриональные стволовые клетки

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

Плюсы

  • Транс-дифференцировка и перепрограммирование этих клеток возможно, но недостаточно изучено
  • Считается, что менее вероятно, что будет отвергнут при использовании в трансплантатах
  • Успех уже продемонстрирован в различных клинических применениях
  • Может сохраняться и расти в культуре 1 год и более
  • Установленные протоколы поддержания в культуре
  • ESC представляют собой плюрипотентные клетки, которые могут генерировать большинство типов клеток
  • Изучая ESC, можно больше узнать о процессе разработки

  • Можно использовать обильные соматические клетки донора
  • Проблем гистосовместимости с трансплантатами донора / реципиента можно избежать
  • Очень полезно для разработки лекарств и исследований развития
  • Информация, полученная в процессе «перепрограммирования», может быть передана для терапий in vivo для перепрограммирования поврежденных или больных клеток / тканей

Минусы

  • Ограничения на способность ASC различать все еще не определены; в настоящее время считается мульти- или унипотентным.
  • Нельзя выращивать в культуре в течение длительного времени
  • Обычно очень небольшое количество в каждой ткани, что затрудняет их поиск и очистку
  • В настоящее время не существует технологии для получения больших количеств стволовых клеток в культуре

  • Процесс генерации строк ESC неэффективен
  • Не уверен, будут ли они отклонены при трансплантации.
  • Терапия с использованием средств ESC в значительной степени нова, и требуется гораздо больше исследований и испытаний
  • При использовании непосредственно из недифференцированного культурального препарата ESC для трансплантации тканей они могут вызывать опухоли (тератомы) или развитие рака
  • Методы обеспечения воспроизводимости и сохранения, поскольку дифференцированные ткани не определены.
  • Вирусы в настоящее время используются для введения эмбриональных генов, и в исследованиях на мышах было показано, что они вызывают рак

Этические проблемы

  • Серьезных этических проблем не возникало
  • Для получения внутренней клеточной массы эмбрион разрушается
  • Риск согласия женщин-доноров

  • iPS-клетки могут стать эмбрионами при воздействии правильных условий

Эмбриональные стволовые клетки человека, полученные без питающих клеток

Фон: Эмбриональные стволовые клетки человека, вероятно, будут играть важную роль в будущем регенеративной медицины.Однако воздействие на существующие линии эмбриональных стволовых клеток человека живыми клетками животных и сывороткой создает риск заражения патогенами, что может привести к риску для здоровья человека. Мы стремились получить линию эмбриональных стволовых клеток без контакта с клетками или сывороткой.

Методы: Замороженные эмбрионы на стадии дробления размораживали и культивировали до стадии бластоцисты. Внутренние клеточные массы выделяли с помощью иммунохирургии и помещали на планшеты, покрытые внеклеточным матриксом, которые можно легко стерилизовать.Шесть установленных линий эмбриональных стволовых клеток человека также поддерживались с помощью этой системы культивирования без сыворотки и питателя.

Выводы: Новая линия стволовых клеток была получена из человеческих эмбрионов в полностью свободных от клеток и сывороток условиях. Клетки поддерживали нормальный кариотип и маркеры плюрипотентности, включая октамер-связывающий белок 4 (Oct-4), стадийно-специфический эмбриональный антиген (SSEA) -3, SSEA-4, антиген отторжения опухоли (TRA) -1-60, TRA- 1-81 и щелочная фосфатаза.После более чем 6 месяцев недифференцированной пролиферации эти клетки сохранили способность образовывать производные всех трех зародышевых листков эмбриона как in vitro, так и в тератомах. Эти свойства также успешно поддерживались (более 30 пассажей) с помощью установленных линий стволовых клеток.

Интерпретация: Эта система исключает воздействие человеческих эмбриональных стволовых клеток и их потомков на кормовые слои животных и человека и, таким образом, исключает риск заражения патогенными агентами, способными передавать болезни пациентам.

Достижения и прогресс отдела технологий водородных и топливных элементов

Снижена стоимость отпускаемого водорода. Прогнозируемые затраты на производство, доставку и распределение водорода для заправки топливом под давлением 700 бар (с учетом больших объемов производства и широкого развертывания) были снижены до ~ 5-7 долларов за 1 литр, что делает его почти конкурентоспособным по стоимости с бензином. 4

Снижение затрат на производство водорода из возобновляемых источников. Научно-исследовательские достижения снизили стоимость электролизеров на 80% с 2002 года. 5

Исследования и разработки в области ускоренного производства водорода. Достигнуты мировые рекорды в области прямого фотоэлектрохимического производства водорода и проверено более 1000 материалов для термохимического производства водорода. 6

Запустил h3FIRST и разработал первое в мире устройство HyStEP. В рамках проекта «Исследования инфраструктуры водородной заправки и технологии станций» (h3FIRST) был разработан прототип испытательного устройства для проверки характеристик оборудования водородной станции (HyStEP).В настоящее время прототип демонстрируется в Калифорнии, что позволяет новым станциям соответствовать требованиям протокола заправки.

Снижение стоимости современных бортовых систем хранения сжатого водорода на 30% с 2013 года. 7 Продвинутая теория и моделирование, необходимые для разработки материала, который связывается с водородом достаточно прочно, чтобы соответствовать как гравиметрической, так и объемной емкости в семь раз более низкое давление по сравнению с сегодняшними технологиями (100 бар по сравнению с 700 бар).

Снижение стоимости стационарного хранения водорода. Advancements в области НИОКР снизила стоимость стационарного хранилища водорода под давлением 875 бар более чем на 30% с 2011 года, с 1450 долларов за кг до 1000 долларов за кг за счет использования сосудов высокого давления с проволочной обмоткой. 8

Установленные инструменты анализа водородной технологии. Разработанные модели и инструменты в настоящее время используются во всем мире для анализа затрат на производство, доставку водорода и инфраструктуру (h3A, HRSAM, 10 HDSAM, h3FAST 9 ).

Терапия NK-клетками — Kiadis

Терапия NK-клетками

Начало будущего терапии NK-клетками

Уже давно известно, что природные киллеры (NK) играют важную роль в врожденном иммунитете организма. отклик. Впервые они были описаны в 1970-х годах, но только за последние 15 лет был достигнут значительный прогресс в понимании сложности и терапевтического потенциала, который эти клетки предлагают в борьбе с раком и другими заболеваниями. 1 Сегодня мы знаем, что NK-клетки не только обнаруживают и идентифицируют злокачественные раковые клетки, но также вызывают гибель раковых клеток 4,5 и даже помогают запускать более широкий адаптивный иммунный ответ, чтобы полностью взаимодействовать с опухолевыми клетками и бороться с ними. 6,7

Наша технология, основанная на десятилетиях фундаментальных исследований, является лидером в современной области терапии NK-клетками. Наша уникальная технология обработки частиц обеспечивает улучшенный и устойчивый рост высоких доз NK-клеток, которые обладают широким набором «убийственных» противораковых функций, создавая иммуноонкологическую платформу с потенциалом для лечения некоторых из наиболее сложных на сегодняшний день видов рака.

Клинические исследования показали, что высокие дозы NK-клеток, вводимые в качестве адоптивной иммунотерапии, могут уменьшить остаточную болезнь и усилить способность организма бороться с раком. 8–10

1.Chiossone L и др., Естественные клетки-киллеры и другие врожденные лимфоидные клетки при раке. Nat Отзывы 18; 671-688 (2018)
4. Bottcher, J. P. et al. NK-клетки стимулируют рекрутирование cDC1 в микросреду опухоли, способствуя иммунному контролю над раком. Cell 172, 1022–1037 (2018).
5.Паллмер К. и Оксениус А. Распознавание и регуляция Т-клеток NK-клетками. Передний. Иммунол. 7, 251 (2016).
6. Славин С., Мореки С., Шапира М.Ю. и др. Использование согласованных или несоответствующих rIL-2 активированных донорских лимфоцитов, положительно отобранных по CD56 +, для иммунотерапии резистентного лейкоза после трансплантации аллогенных стволовых клеток. Журнал клинической онкологии. 2004; 22 (14_suppl): 6516-6516.
7. Баркхольт Л., Алиси Е., Конрад Р. и др. Анализ безопасности ex vivo NK- и NK-подобных T-клеток, вводимых онкологическим больным: клиническое исследование фазы I.Иммунотерапия. Сентябрь 2009 г .; 1 (5): 753-764.
8. Koehl U, Kalberer C, Spanholtz J, et al. Достижения в клинических исследованиях NK-клеток: отбор, производство и контроль качества доноров. Онкоиммунология. Апрель 2016; 5 (4): e1115178.
9. Рицциери Д.А., Стормс Р., Чен Д.Ф. и др. Инфузии донорских лимфоцитов, обогащенных естественными клетками-киллерами, из соответствующего члена семьи A 3-6 / 6 HLA после трансплантации немиелоаблативных аллогенных стволовых клеток. Пересадка костного мозга Biol. Август 2010; 16 (8): 1107-1114.
10. Такар М., Хари П., Мэлони Д. Г. и др.Профилактическая иммунотерапия естественными клетками-киллерами после трансплантации HLA-гаплоидентичных гемопоэтических клеток предотвращает рецидив и улучшает выживаемость пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями высокого риска. Кровь. 2016; 128 (22): 1161-1161.

Достижения и проблемы коммерциализации технологии солнечных элементов на основе перовскита с органическими и неорганическими галогенидами

https://doi.org/10.1016/j.mtener.2017.09.008Получить права и контент

Основные моменты

Большие площади методы осаждения перовскитовой пленки для промышленного производства перовскитных солнечных элементов и модулей.

Стандарты измерения стабильности и срока службы устройства, а также вопросы, связанные с коммерциализацией.

Токсичность свинца и возможные решения.

Реферат

При переносе фотоэлектрических технологий из производства в лабораторных условиях в промышленные приложения важными атрибутами являются низкая стоимость, большая площадь, высокая производительность, высокая эффективность преобразования солнечной энергии в энергию, длительный срок службы и низкая токсичность.В последние годы солнечные элементы на основе перовскита на основе органических и неорганических галогенидов стали перспективной высокопроизводительной и экономичной технологией солнечных элементов. Тем не менее, большинство из лучших заявленных значений эффективности было получено на устройствах с небольшой активной площадью (∼0,1 см 2 ). Поэтому разработка протоколов для индустриализации такой технологии имеет первостепенное значение. В этой статье мы рассмотрим развитие перовскитных солнечных элементов с особым акцентом на производственные процессы и приборы, обладающие потенциалом масштабирования.Для успешной коммерциализации важна способность изготавливать модули большой площади. Обсуждается долгосрочная стабильность с упором на протоколы измерения срока службы и количественной оценки для коммерциализации. Обсуждается анализ эффективности затрат и оценки жизненного цикла, основанный на недавно опубликованных современных перовскитных солнечных элементах. Эти анализы позволяют получить представление о требуемой эффективности, размере площади модуля и сроке службы, чтобы солнечные элементы из перовскита были конкурентоспособными с существующими фотоэлектрическими технологиями.Наконец, будут обсуждены токсичность свинца и возможные решения этой проблемы. В перспективе мы намечаем направления будущих исследований, основанные на опубликованных результатах и ​​тенденциях в этой области.

Ключевые слова

Перовскитный фотоэлемент

Крупномасштабный

Срок службы

Анализ эффективности затрат

Токсичность

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2017 Авторы. Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Невирусная, неинтегрирующая ДНК-нановекторная платформа для безопасного, быстрого и постоянного производства рекомбинантных Т-клеток

Генетический состав описанных здесь векторов S / MARt был уточнен и оптимизирован для производства ряда недавно разработанных ДНК-векторов, которые могут эффективно генетически модифицировать первичные Т-клетки без какого-либо молекулярного или генетического воздействия (рис.1А). Во-первых, мы модифицировали pEPI ( 19 ), генерируя pS / MARt, плазмидный вектор, в котором мы уменьшили размер бактериального остова с 3 до 1,5 т.п.н. путем удаления ненужных последовательностей ДНК и сохранения только бактериального ориджина репликации (Ori) и маркер селекции бактериального антибиотика канамицин (KanR). В кассете эукариотической экспрессии, управляемой вирусным промотором цитомегаловируса (CMV), мы связали экспрессию маркера селекции пуромицина (Puro) непосредственно с репортерным геном зеленого флуоресцентного белка (GFP) через последовательность самоотщепления P2A ( 20 ).Транскрипция экспрессионной кассеты GFP-Puro оканчивается внутри последовательности S / MAR, выделенной из кластера человеческого интерферона-β (IFN-β) (IFN-β S / MAR), способствуя его функциональности, что приводит к внехромосомному поддержанию плазмиды. ДНК ( 21 ). Путем внесения этих изменений мы создали вектор с улучшенной способностью генерировать стабильно трансфицированные клоны в человеческих клеточных линиях человеческой эмбриональной почки (HEK) 293T и HeLa (рис. 1B). Вектор pS / MARt был дополнительно преобразован в вектор минимального размера nS / MARt путем сохранения кассеты экспрессии и замены бактериального остова, содержащего Ori и KanR, на систему отбора без антибиотиков, описанную Luke et al. ( 18 ). Stehle et al. ( 22 ) продемонстрировал, что транскрипционная активность через мотив S / MAR важна для функции. Однако транскрипты клеточной мРНК, которые включают участки AU-богатых элементов (ARE), распознаются и быстро разрушаются человеческим антигеном R ( 23 ). Поскольку мотивы S / MAR представляют собой участки геномной ДНК, обогащенные аденином и тимидином, мы ввели сайты сплайсинга, чтобы фланкировать IFN-β MAR, генерирующую вектор SP-nS / MARt-B, что приводит к более стабильным транскриптам, которые не содержат посторонних и антагонистических ARE происходят из ненужной транскрипции мотива S / MAR.Активный сплайсинг был продемонстрирован с помощью Нозерн-блоттинга (фиг. S1A), где исследовалась длина транскрипта конструкций, полученных из pS / MARt, nS / MARt и SP-nS / MARt. На последнем этапе развития мы заменили IFN-β S / MAR более компактной версией, выделенной из кластера генов человеческого аполипопротеина B (ApoB) ( 24 ), который мы также фланкировали сайтами сплайсинга. Сайты прикрепления ядерного матрикса, обнаруженные в определенных AT-богатых областях генов, преимущественно содержат мотивы ATTA-ATTTA, сайты узнавания гомеодоменных белков, высококонсервативные в Ori дрожжей, вирусов, митохондрий, хлоропластов и Ori млекопитающих.ApoB MAR почти полностью состоит из непрерывного участка длиной 555 п.н., состоящего из мозаики мотивов TAAT, TAAAT, ATTA, ATTTTA, TAAAAT и ATTTA. Эффективность укоренения, измеренная как количество колоний, генерируемых каждым вектором, продемонстрировала, что последняя версия, нановектор SP-nS / MARt-A, была наиболее эффективной, формируя наибольшее количество колоний по сравнению с предыдущими поколениями векторов. в клетках HEK293T и HeLa (рис. 1Б). SP-nS / MARt-A не только генерировал наибольшее количество колоний, но также обеспечивал лучшую эффективность трансфекции с наивысшим уровнем экспрессии GFP [средняя интенсивность флуоресценции (MFI)] через 24 часа после доставки ДНК.Результат был также подтвержден, когда клетки были проанализированы через 30 дней после доставки ДНК (рис. S1B). В модифицированных клетках эписомальный статус векторов на основе S / MAR был продемонстрирован с помощью саузерн-блоттинга (рис. 1С), где присутствие отдельных полос в полных экстрактах ДНК установленных клеток показало эписомальные формы этого класса векторов. Повторяющуюся структуру последовательности ApoB MAR фрагментировали, чтобы исследовать, достаточно ли коротких мотивов этой последовательности для поддержания функциональности векторов.Мы создали семь различных версий, последовательности которых различались по нуклеотидному составу, ориентации и длине (рис. S1C), которые были исследованы на предмет их способности создавать стабильные клетки в HEK293T и HeLa. В обеих линиях клеток человека наиболее активной оказалась полноразмерная последовательность ApoB MAR дикого типа. Затем мы создали вектор SP-nS / MARt-A, в котором мы заменили промотор CMV на промотор EF1α человека ( 25 ), и мы протестировали эту конструкцию на линии клеток рака Т-клеток человека Jurkat76 (J76) ( 26 ).Мы продемонстрировали, что векторы могут быть эффективно и последовательно доставлены путем электропорации с более чем 80% жизнеспособных клеток, экспрессирующих репортерный ген (рис. 1D). Чтобы изолировать клетки, в которых активно сохранялся вектор, от остальной популяции, через 15 дней после доставки клетки GFP + выделяли посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), а затем культивировали в течение 360 дней. Мы смогли успешно создать три независимые клеточные линии, которые регулярно контролировали на предмет процентного содержания клеток GFP + (GFP%) и интенсивности экспрессии (GFP MFI) (рис.1D), и мы продемонстрировали, что в течение этого длительного периода GFP% и GFP MFI оставались стабильными. Эпизомальную передачу плазмид проверяли на 360 день с помощью саузерн-блоттинга (фиг. S1D) и определяли число копий ~ 1,71 копий на клетку (фиг. S1E). В соответствии с предыдущими сообщениями ( 19 , 27 , 28 ), векторы, несущие S / MAR, реплицируются внехромосомно в ядрах делящихся клеток, где они устанавливаются с низким числом копий. Устойчивую экспрессию репортерного гена GFP также тестировали на первичных человеческих клетках CD3 + в течение 27 дней.Клетки CD3 + , выделенные от четырех разных здоровых доноров, трансфицировали векторами nS / MARt, несущими IFN-β и ApoB MAR, по сравнению с pEPI (фиг. 1E). Доставка вектора посредством электропорации не изменяла соотношение CD4: CD8 по сравнению с имитацией электропорированных клеток (фиг. S1F). Однако 60% всех клеток, трансфицированных pEPI, не показали экспрессии GFP через 10 дней после доставки ДНК (рис. S1G), которая почти полностью исчезла к 27 дню, в то время как 40% клеток, трансфицированных SP-nS / MARt-A векторы остались GFP + .SP-nS / MARt-A показал значительно уменьшенный процент потери клеток GFP + по сравнению с pEPI и векторами nS / MARt на основе IFN-β. Более того, мы продемонстрировали, что пролиферация Т-клеток, трансфицированных вектором SP-nS / MARt-A, была сопоставима с необработанными контролями CD3 + , что указывает на минимальное влияние ДНК-векторов и системы доставки ДНК на пролиферацию клеток ( рис. S1H). Эписомальная персистенция векторов в первичных лимфоцитах была продемонстрирована с помощью амплификации по кругу (RCA) (рис.1F). Для дальнейшего изучения возможности использования этой новой технологии ДНК-вектора в клинической практике мы заменили репортерный ген GFP в векторе SP-nS / MARt-A для CAR против карциноэмбрионального антигена человека (CEA) и промотора CMV. для промотора PGK (фосфоглицераткиназы), генерирующего вектор SP-nS / MARt-CEA. Эффективность доставки и экспрессии трансгенного CAR оценивали с использованием двух различных крупномасштабных устройств электропорации: Lonza LV Unit и платформы MaxCyte ExPERT GTx с 1 × 10 8 и 3 × 10 8 CD3 + клеток. соответственно.С обоими устройствами, по сравнению с соответствующими имитацией электропорированных клеток CD3 + , доставка вектора обеспечивала жизнеспособность клеток, которая составляла от 50 до 75% в зависимости от донора с процентным содержанием Т-клеток CAR + от 65 до 80%, через 24 часа после доставки ДНК (рис.