Смирнова 6 класс: Английский язык. 6 класс. Учебник | Смирнова Елена Юрьевна, Дерков-Диссельбек Барбара

Содержание

ГДЗ по истории 6 класс Бгажнокова, Смирнова Просвещение ответы и решения онлайн

Подросткам, имеющим интеллектуальные особенности, особенно сложно дается обучение в средней школе. Переходный возраст добавляет проблем, поэтому именно в средних классах следует постараться найти и развить те или иные интересы у ребят, помочь преодолеть возникающие трудности в ходе получения образования. Сделать это можно, в том числе, при помощи специализированных источников. Хорошо зарекомендовали себя в решении этого вопроса гдз по истории 6 класс Бгажнокова, главное — грамотно и эффективно организовать работу с этим источником. В первую очередь, это означает регулярность занятий. Необязательно проводить их каждый день. Хотя если ребенку интересно или такой график не вызывает усталости, специалисты говорят, что он оптимальный для получения необходимых знаний. Кроме того, желательно отказаться от долгих, более двух-трех недель, перерывов в подготовке, поскольку часть программы в этом случае окажется забытой.

А последующее наверстывание приведет к усталости, ухудшению усвоения знаний.

Приоритетные категории пользователей онлайн справочника

Сегодня онлайн решения по учебнику истории за 6 класс Бгажноковой чаще всего применяются такими пользователями:

  • подростками, часто пропускающими школьные занятия по тем или иным объективным причинам. Разбирая впоследствии пропущенное, они смогут понять, как именно получены ответы на те или иные вопросы учебника, каким образом следует изучать материал, оформлять решение;
  • репетиторами, занимающимися со школьниками с особенностями интеллектуального развития. Платформа позволит им увидеть, как именно нужно оформлять ответы, алгоритм и логику их получения в строгом соответствии с нормативами образовательных Стандартов, на которые опирается решебник;
  • родителями шестиклассников, желающими помочь своему ребенку. Работая с площадкой, они смогут вникнуть в методику преподавания, и, при желании, доходчиво и понятно объяснить детям даже сложные задания и вопросы;
  • учителями, начинающими работать с детьми, имеющими особенности при обучении. Источник позволит педагогам составить грамотный план работы и следовать ему для получения максимально качественных результатов.

Ощутимая польза от применения ответов по истории для 6 класса (авторы Бгажнокова, Смирнова)

Пока не все преподаватели и родители убедились в полезности еуроки ГДЗ. Но отрицающих пользу этих материалов становится все меньше. Многие оценили такие преимущества справочников, как:

  • постоянная круглосуточная доступность для всех;
  • понятность и четкость изложенных решений;
  • простота нахождения ответа, возможность его быстрого применения;
  • возможность заменить сборником дорогостоящие занятия с репетитором, сэкономить семейный бюджет.

Удобный в применении сборник готовых решений поможет всем заинтересованным пользователям в достижении их цели. Его по праву оценили многие из тех, для кого он стал незаменим.

Контрольная работа 6 класс unit 1. Back to school. Алексеев.А.А., Смирнова Е.Ю.

6th form unit 1 name_______________________________________

Variant 1

1. Сделайте предложения отрицательными в present simple.

1. He stays with his aunt in the city.

_________________________________________________________________

2. She says “Good morning”.

__________________________________________________________________

3.We want to go home.

___________________________________________________________________

2. Сделайте предложeния отрицательными в Past Simple.

1. They went to New York by plane.

____________________________________________________________________

2. Sophie talked to the new girl

____________________________________________________________________

3. Mary wrote them emails yesterday.

______________________________________________________________________

3.Задайте вопросы к подлежащему или дополнению.

1. Who/talk to her?____________________________________________________

2. Who/Kate/phoned a week ago?_________________________________________

3. Who/came to school?___________________________________________________

4.Who/Ananda/told the secret?____________________________________________

4. Соотнесите слова с их переводом.

6th form unit 1 name_______________________________________________________________

Variant 2

1.Сделайте предложения отрицательными в present simple.

1. Jo goes to the shop every day.

_________________________________________________________________________

2. We play badminton in school.

______________________________________________________________________________

3. Ananda swims in the swimming pool on Sundays.

________________________________________________________________________________

2. Сделайте предложения отрицательными в past simple.

1. They went on holidays with the family.

_______________________________________________________________________________

2. My father watched TV yesterday.

________________________________________________________________________________

3. Sophie saw her friend.

_________________________________________________________________________________

3. Задайте вопросы к подлежащему или дополнению.

1. Who/ drives a car?______________________________________________________________

2. Who/Dan saved on the beach?___________________________________________________

3. Who/told you that?____________________________________________________________

4. Who/ David makes this work?_________________________________________________________

4. Соотнесите слова с их переводом.

ГДЗ по Английскому языку для 6 класса Алексеев А. А., Смирнова Е. Ю., Дерков Д. Б., Харгер Л.

Авторы: Алексеев А. А., Смирнова Е. Ю., Дерков Д. Б., Харгер Л..

Издательство: Просвещение 2018

«ГДЗ по Английскому языку для 6 класса Учебник Алексеев (Просвещение)» станет для шестиклассника незаменимым участником достойного выполнения домашнего задания по первому иностранному языку. Представленный решебник позволит подростку самостоятельно подготовиться к уроку, без помощи родителей или педагога. Подкованный ученик перестанет бояться получить двойку за неправильный ответ и начнет сам тянуть руку для выхода к доске. Рассмотрим основные положительные качества учебно-методического пособия:

  • размещено в онлайн-формате на популярном интернет-ресурсе;
  • обеспечит полное понимание каждой пройдённой на уроке темы;
  • несёт в себе верные ответы;
  • присутствует простой и понятный интерфейс поиска нужных заданий по номеру из учебника.

К тому же, правильное применение решебника в образовательном процессе поможет шестиклассникам не только подтянуть свои оценки и улучшить успеваемость, но и обрести множество новых знаний в рамках этой гуманитарной дисциплины.

Образовательный процесс по английскому языку

На уроках по первому иностранному языку школьники смогут познакомиться с множеством новых иностранных слов. Они подробно разберут важнейшие теоретические аспекты, касающиеся основ грамматики, стилистики и фонетики. Рассмотрим несколько фундаментальных параграфов в рамках данного лингвистического предмета: глаголы, выражающие долженствование, словообразование с использованием суффиксов и префиксов, определенные артикли. Для того чтобы всецело освоить перечисленные темы и «не ударить в грязь лицом» при ответе у доски или написании важной контрольной работы, школьникам необходимо вмешательство сертифицированного вспомогательного ресурса. С этой задачей отлично справится учебно-методический комплекс

«ГДЗ по Английскому языку для 6 класса Учебник Алексеев А.
А., Смирнова Е. Ю., Дерков Д. Б., Харгер Л. (Просвещение)».

Безопасно ли использовать решебник по Английскому языку для 6 класса Учебник Алексеев в обучении

Немаловажен и тот факт, что представленный сборник верных ответов был разработан опытными специалистами в области гуманитарных наук и соответствует всем требованиям федерального государственного образовательного стандарта. Благодаря этому, ученики могут не сомневаться в правильности выложенных ответов. Таким образом, пособие ГДЗ сможет сугубо положительно повлиять на оценки и успеваемость юных пользователей.

Смирнова Светлана Викторовна

учитель математики

 

           Высшая квалификационная категория.
          Высшее профессиональное образование.

  Санкт-Петербургский университет повышения квалификации и профессиональной     переподготовки (2019 г.) Направление по специальности — «Педагогическое образование:   учитель математики».  Квалификация — «Учитель математики».

  Санкт-Петербургский институт психологии и акмеологии (2014 г.), Направление по   специальности  —  «Психология». Квалификация — «Психолог, преподаватель психологии».

  Ленинградское педагогическое училище № 1 им. Н.А. Некрасова (1983 г.) Направление   по специальности — «Преподавание в начальных классах  общеобразовательной     школы». Квалификация — «Учитель начальных классов».
         Работа в гимназии с 01.09.2018 г.

 

Учебная нагрузка на 2020-2021 учебный год:  алгебра, геометрия в 9-Д классе, математика в 6-Г, 6-К классах, математика в 5-К классе. Внеурочная деятельность в 5-Г, 6-Г, 6-К, 9-Д  классах. Классное руководство: 6-Г класс.

Е-mail:[email protected]

Курсы повышения квалификации

2016 г. — ФГБОУДПО «Институт непрерывного образования взрослых» Психолого-педагогическое и методическое обеспечение коррекционного обучения.  
2014 г. — Санкт-Петербургская академия постдипломного образования, «ФГОС: теория и методика обучения математике (основная школа)»

2018 г.- Балтийский Гуманитарный Институт СПбЧОУВО.»Информационно-коммуникационные технологии в образовании»

2018 г.— В рамках программы » Охрана труда и безопасность производственной деятельности » курс теоретического и практического обучения «Оказание первой помощи при несчастных случаях».

2020 г. — ООО «Инфоурок»  «Организация работы с обучающимися с ограниченными возможностями здоровья (ОВЗ) в соответствии с ФГОС»

2020 г,-  Независимая международная аттестация «Механизмы повышения качества обучения: перспективы использования опыта финской школы»

2020 г, — ООО «Центр инновационного образования и воспитания»,  «Организация деятельности педагогических работников по классному руководству»

 Грамоты и благодарности

   Грамота Президиума ЦК Профсоюза за многолетнюю и плодотворную работу, активное участие в деятельности отраслевого  Профсоюза.
   Грамота Комитета по образованию Санкт-Петербурга за лучшую организацию отдыха и оздоровления детей и молодёжи.
   Грамота Совета Санкт-Петербургского городского отделения Всероссийской общественной организации ветеранов «Боевое братство» за добросовестную работу в деле военно-патриотического воспитания населения, а так же за большой личный вклад в общественно-политическую жизнь города.

  Диплом сетевого издания «Педагогический успех». Победитель (I место) Всероссийской олимпиады «Педагогический успех» в номинации: «Требования ФГОС к работе с одарёнными детьми»

  Сертификат образовательной платформы Учи,ру Присвоение статуса «Эксперт в онлайн-образовании» в рамках программы «Активный учитель»

  Грамота образовательной платформы Учи,ру за использование интернет-технологий для дистанционного обучения,

  Благодарность проекта «Инфоурок»за существенный вклад в методическое обеспечение учебного процесса по преподаваемой дисциплине в рамках крупнейшей онлайн-библиотеки методических разработок для учителей,

 Благодарность института повышения квалификации и профессиональной переподготовки за участие в жюри олимпиады  Бесплатная Всероссийская образовательная  олимпиада по русскому языку 5-6 классов в соответствии с ФГОС.

 

                                                                        Публикации

2020 г, — Методическая разработка «Внеклассная работа по математике в 7-9 классах» в печатном издании Лучшие материалы «Инфоурок» — 2020 (IV часть)

2020 г. — Методическая разработка «Рабочая программа по математике, 5 класс». Инфоурок

2020 г, — Методическая разработка «Презентация по математике на тему «Действия с десятичными дробями. Решение задач с помощью уравнений». 5 класс». Инфоурок

Достижения обучающихся

 

2018-2019 уч.год — Международный конкурс по математике “Кенгуру” —  Лохманова Алина (9Д), 3 место в районе.

 

 

Восемь представителей Прикамья готовятся принять участие в Олимпийских играх в Пекине

4 февраля в Пекине стартуют зимние Олимпийские игры. На участие в главных стартах четырехлетия претендовали 24 спортсмена Пермского края. Пройти жесткий отбор удалось не всем. Кроме того, корректировки в состав олимпийских сборных – не только российской – ежедневно вносит коронавирус. Так что не исключено, что нам еще предстоит делать поправки с «отобрались», что тоже само по себе почетно, на «примут участие».

Евгений Климов включен в состав национальной команды по прыжкам на лыжах с трамплина. В этом сезоне пермяк уверенно входит в ТОП-30 на этапах Кубка мира, а лучший его результат – 5 место на швейцарском этапе.

Напомним, ранее в состав Олимпийской сборной России для участия в зимних Играх в Пекине вошли лыжница Мария Истомина и саночницы Татьяна Иванова и Екатерина Катникова. Обе саночницы — воспитанницы чусовской СШОР «Огонек» им. Л.Д. Постникова. Первая является многолетним лидером национальной команды, но нынешний сезон для Ивановой получился сложным. 21 ноября на первом этапе Кубка мира в китайском Яньцине она получила тяжелую травму ноги. Только в январе она провела первый старт после восстановления. В Сигулде она заняла первое место в спринтерской гонке и третье в индивидуальной дисциплине. Екатерина Катникова в этих видах показала 8 и 9 результаты, соответственно.

Федерация фристайла России также объявила состав олимпийской команды. В дисциплине могул женская команда на 100% состоит из воспитанниц чусовской СШОР «Огонек» им. Л.Д. Постникова. На Игры в Пекин отправятся Анастасия Смирнова, Виктория Лазаренко, Анастасия Первушина и Полина Чудинова.

Напомним, в прошлом сезоне Анастасия Смирнова выиграла «золото» в парном могуле на чемпионате мира по фристайлу в Казахстане. В финале она опередила Викторию Лазаренко. Это первое в истории России «золото» в этой дисциплине.

«На протяжении многих лет чусовская школа олимпийского резерва является кузницей кадров для сборной России. В этом году сразу 6 ее воспитанниц будут представлять страну на Олимпийских играх. Это огромная гордость и колоссальная работа! Уверена, она принесет свои плоды в Пекине», — поделилась министр физической культуры и спорта Пермского края Татьяна Чеснокова.

Также в расширенный состав олимпийской команды по фигурному катанию вошла пермская пара Юлия Артемьева и Михаил Назарычев. Воспитанники СШОР «Старт», спортсмены ЦСП Пермского края заявлены в состав российской команды в статусе запасных.

Прикамская стреляющая лыжница Валерия Васнецова, которая тренерским штабом Союза биатлонистов России была включена в состав команды для участия в Играх, к сожалению, после положительных тестов на коронавирус принять участие в Олимпиаде не сможет.

Cushman & Wakefield. Игроки рынка на CRE.ru

Консалтинг и брокеридж
Москва

Cushman & Wakefield является одной из крупнейших компаний рынка коммерческой недвижимости, команда которой насчитывает порядка 50 000 сотрудников в 400 офисах и 60 странах мира. В 2020 году доход C&W составил $7,8 млрд. Подробнее – на www. cwrussia.ru

Связанные материалы (298)

Источник: mkchita.ru

Богатые тоже ходят
Текст: Влад Лория О том, что в «низкие форматы» за покупками ходят уже не только и не столько у…

Источник: makler. su

Место красит
Текст: Евгений Арсенин Фото: Архив CRE Retail, Kanayan Retail&Development Consulting   Пандемия и …

Источник: WeWork

WeWork и Cushman & Wakefield подружились
Компании объявили об эксклюзивном стратегическом партнерстве для создания инновационной гибкой платформы рабоч…

Источник: Cushman & Wakefield

Cushman & Wakefield усиливает управление
Руководителем направления разработки стратегии организации рабочего пространства назначена Олеся Липкович.

Источник: Cushman & Wakefield

Cushman & Wakefield переехала
Новый офис компании расположился в «Space 1 Тверской бульвар». …

Источник: CRE

Итоги 2020 года (часть 2)
Торговая, складская и гостиничная недвижимость — все, что вы хотели знать о состоянии рынка коммерческой недви…

Источник: CRE

Итоги 2020 года (часть 1)
Макроэкономические показатели, инвестиции, офисная, торговая недвижимость — все, что вы хотели знать о состоян. .. Cushman & Wakefield исследует Сочи
Компания в седьмой раз выиграла тендер на мониторинг олимпийских объектов, построенных на деньги ВЭБа, в том ч… «Алкон» продлил аренду
Одна из крупнейших компаний в области офтальмологии арендовала более 2 тыс. кв. м в Москве.  … В Москве не так уж дорого
Ставки аренды стрит-ритейла на гонконгской Козуэй-Бей почти в 10 раз выше, чем на самой дорогой улице Москвы. … Россию ожидает бум аутлетов
Из-за бурного развития онлайн-ретейла европейский рынок торговой недвижимости столкнется с новыми вызовами, ко. .. В Ташкенте построят МДЦ
Компания Cushman & Wakefield разработала коммерческую концепцию Международного делового центра «Ташк… Персона года
CRE Moscow Awards 2018 — уже сегодня. Представляем последнюю номинацию Премии, в которой оценивается личный вк…

12.04.2018

Денис Соколов
Денис Соколов, партнер Cushman & Wakefield, о последствиях санкций, инфляции и ключевой ставке ЦБ. …

12.03.2018

Денис Соколов
Денис Соколов, Cushman & Wakefield, рассуждает о продаже O1 Properties…

19. 01.2018

Денис Соколов
Денис Соколов, Cushman & Wakefield, рассуждает о рынках Восточной и Центральной Европы, их инвестиционной … О чем шепчут склады?..
Предновогодний сезон мероприятий, как и полагается наиболее гибкому и инновационному сегменту, начал рынок скл… В Cushman & Wakefield еще назначение
В качестве старшего директора к команде отдела гостиничного бизнеса и туризма присоединился Николай Мороз. … Herbalife сел в «СИТИДЕЛ»
Компания, известная, как производитель продуктов сбалансированного питания, арендовала 2 тыс. кв. м офисных по… Сергей Рябокобылко
Как и в прошлые периоды рыночных потрясений, потребность в консультациях грамотных и опытных специалистов сейч. .. Cushman & Wakefield объединится с DTZ
Этот шаг позволит объединенной компании стать одним из крупнейших глобальных игроков рынка коммерческой недви… Итоги сентября 2009 г.
Компания Cushman & Wakefield Stiles & Riabokobylko опубликовала новый обзор по инвестициям в коммерчес…

Лекомцев, Голубков и Михеева стали абсолютными победителями общего зачета Кубка мира МПК по лыжным гонкам и биатлону | ПКР

С 27 января по 1 февраля в г. Эстерсунд (Швеция) сборная России по лыжным гонкам и биатлону приняла участие в заключительном этапе Кубка мира Международного паралимпийского комитета спортивного сезона 2021/2022 года.

I этап проходил с 4 по 12 декабря в г.Кенмор (Канада) российские спортсмены завоевали на нем 65 медалей – 19 золотых, 23 серебряные и 23 бронзовые и выиграли медальный зачет соревнований. III этап должен был пройти в японском Саппоро с 17 по 21 марта, но был отменен.

По итогам текущего спортивного сезона победителями общего зачета Кубка мира стали:

Владислав Лекомцев и Иван Голубков стали абсолютными чемпионами по лыжным гонкам и по биатлону в категориях стоя и сидя соответственно.

Юлия Михеева впервые стала обладательницей хрустальных глобусов, первенствовав в лыжных гонках и биатлоне (категория “стоя”).

Среди спортсменов с нарушением зрения в общем зачете по лыжным гонкам победителем стал Олег Пономарев (спортсмен-ведущий Андрей Романов), а в общем зачете по биатлону — Станислав Чохлаев (спортсмен-ведущий Олег Колодийчук).

Среди женщин Анна Панферова (спортсмен-ведущий Андрей Жуков) заняла первое место в зачете по лыжным гонкам, а Вера Хлызова (спортсмен-ведущий Наталья Якимова) — по биатлону.

В финальном этапе Кубка мира в Швеции принимали участие спортсмены из 18 стран.

Сборная команда России выиграла медальный зачет соревнования, завоевав 9 золотых, 13 серебряных и 12 бронзовых медалей. Второе место в медальном зачете заняла сборная Украины: 5 золотых, 6 серебряных и 2 бронзовые медали.

27 января прошли соревнования по лыжным гонкам на средней дистанции. Победителями и призерами соревнований в первый день Кубка стали:
I место — Александр Проньков (г. Москва), категория «стоя»
I место — Олег Пономарев (Московская область/Пермский край, спортсмен-ведущий Андрей Романов)
II место — Виталий Малышев (Московская область), категория «стоя»
II место — Иван Голубков (г. Москва/Республика Коми), категория «сидя»
II место — Марта Зайнуллина (Республика Татарстан, категория «сидя»
II место — Александр Артемов (г. Москва, спортсмен-ведущий Илья Черепанов)
II место — Анна Панферова (Тульская область, спортсмен-ведущий Андрей Жуков)
III место — Иван Кодлозеров (Архангельская область), категория «стоя»
III место — Владимир Удальцов (Московская область/Тульская область, спортсмен-ведущий Руслан Богачев)
III место — Екатерина Разумная (спортсмен-ведущий Алексей Иванов, Свердловская область)

28 января состоялись соревнования по лыжным гонкам в спринте. Призеры второго соревновательного дня:
I место — Олег Пономарев (Московская область/Пермский край, спортсмен-ведущий Андрей Романов)
I место — Анна Панферова (Тульская область, спортсмен-ведущий Андрей Жуков)
II место — Александр Проньков (г. Москва), категория «стоя»
II место — Данила Бритик (г. Москва), категория «сидя»
II место — Станислав Чохлаев (Тюменская область, спортсмен-ведущий Олег Колодийчук)
II место — Анастасия Багиян (спортсмен-ведущий Сергей Синякин, Пермский край)
III место — Иван Кодлозеров (Архангельская область), категория «стоя»
III место — Юлия Михеева (г. Москва), категория «стоя»
III место — Иван Голубков (г. Москва/Республика Коми), категория «сидя»

30 января прошли соревнования в биатлоне на короткой дистанции. Призеры третьего соревновательного дня:
I место — Владислав Лекомцев (Удмуртская Республика), категория «стоя»
I место — Иван Голубков (г. Москва/Республика Коми), категория «сидя»
I место — Вера Хлызова (Тюменская область, спортсмен-ведущий Наталья Якимова)
I место — Юлия Михеева (г. Москва), категория «стоя»
II место — Александр Проньков (г. Москва), категория «стоя»
II место — Анастасия Багиян (спортсмен-ведущий Сергей Синякин, Пермский край)
III место -Виталий Малышев (Московская область), категория «стоя»
III место — Марта Зайнуллина (Республика Татарстан, категория «сидя»
III место — Станислав Чохлаев (Тюменская область, спортсмен-ведущий Олег Колодийчук)
III место — Екатерина Разумная (спортсмен-ведущий Алексей Иванов, Свердловская область)

1 февраля прошли гонки в биатлоне. Призеры четвертого дня соревнований:
I место — Вера Хлызова (Тюменская область, спортсмен-ведущий Наталья Якимова)
II место — Александр Артемов (г. Москва, спортсмен-ведущий Илья Черепанов)
II место — Юлия Смирнова(Тюменская область, спортсмен-ведущий Роман Тарасов)
III место — Владимир Хайруллин (Пермский край, спортсмен-ведущий Дмитрий Горшков)
III место — Ксения Бережная (Свердловская область, спортсмен-ведущий Илья Широков)

Результаты соревнований: https://www.paralympic.org/nordic-skiing/live-results

Общий зачет Кубка мира МПК по лыжным гонкам: https://db.ipc-services.org/sdms/web/points/ns/pdf/season/W21/category/1/type/WC/discipline/CC

Общий зачет Кубка мира МПК по биатлону: https://db.ipc-services.org/sdms/web/points/ns/pdf/season/W21/category/1/type/WC/discipline/BT

Поздравляем сборную команду России по лыжным гонкам и биатлону с завоеванием 9 золотых, 13 серебряных и 12 бронзовых медалей на заключительном этапе Кубка мира МПК в Швеции!

Лыжные гонки и биатлон — одни из самых медалеёмких видов спорта в программе Паралимпийских игр. Включены в программу I Паралимпийских зимних игр 1976 года в Швеции.

На XII Паралимпийских зимних играх 2018 г. в г. Пхенчхане (Республика Корея) российские спортсмены с ПОДА завоевали 2 золотые, 2 серебряные и 2 бронзовые медали в лыжных гонках и 3 золотые, 4 серебряные и 1 бронзовую в биатлоне.

Сборная команда России по лыжным гонкам и биатлону спорта слепых на XII Паралимпийских зимних играх 2018 года в г. Пхенчхан (Республика Корея) завоевала 2 золотые, 3 серебряные и 1 бронзовую медали. Все награды выиграла представительница Свердловской области Михалина Лысова.

На XIII Паралимпийских зимних играх в г. Пекине будут разыграны 20 комплектов медалей в лыжных гонках и 18 – биатлоне.

Смирнова | Факультет экономики

FactSet создает данные и программные решения для профессионалов в области инвестиций по всему миру, обеспечивая мгновенный доступ к финансовым данным и аналитике, которые инвесторы используют для принятия важных инвестиционных решений. Компания была основана в 1978 году и имеет штаб-квартиру в Норуолке, штат Коннектикут, недалеко от кампуса Стэмфорд.

Все студенты Калифорнийского университета в Стэмфорде теперь имеют доступ к порталу данных FactSet через терминалы, расположенные в библиотеке Джереми Ричарда.Поскольку студенты курса «Финансовая экономика» доктора Смирновой (ECON 3413) участвуют в проекте по оценке компании по своему выбору, они использовали FactSet для получения данных о финансовых показателях и другой информации о выбранной ими компании, ее конкурентах и ​​отрасли. в котором работает компания. Однако в FactSet гораздо больше глубины.

Стэмфордский центр развития карьеры Университета Коннектикута организовал специальный (виртуальный) визит академического специалиста FactSet Энди Хаффа на занятие по финансовой экономике.18 ноября 2021 года Энди продемонстрировала студентам многие возможности портала FactSet. Эти знания помогут студентам не только в выполнении семестрового проекта, но и в развитии навыков анализа данных, а также в использовании этого источника данных в других курсах экономики, а также в других дисциплинах.

Г-жа Энди Хафф также знакомит студентов с различными карьерными возможностями, доступными в FactSet, такими как программа студенческих послов, стажировки и должности помощников по решениям для клиентов.

Специалисты по экономике подготовлены для самых разных профессий, но в настоящее время особый интерес вызывают работы в области анализа данных. Наличие платформы FactSet в кампусе Стэмфорда играет важную роль в повышении готовности наших студентов к карьере в этой области.

6 марта 2020 г. д-р Наталья Смирнова и д-р Тяньсю Чен представляли Департамент экономики на «Дне женщин и девочек в Капитолии 2020», организованном Советом губернатора по делам женщин и девочек, Комиссией по делам женщин, детей, Пожилые люди, справедливость и возможности; и Комиссия по избирательному праву женщин.

Тема мероприятия: ПРАЗДНУЙТЕ – ПОДКЛЮЧИТЕ – ВДОХНОВИТЕ:

К ПРАЗДНУЮТ прогресс, достигнутый женщинами в честь Месяца истории женщин и 100-летия избирательного права женщин.

Кому ПОДКЛЮЧИТЕ сообщество штата к ресурсам и возможностям, доступным для общественности, таким как:

  • Информация о карьере.
  • Услуги и информация по охране труда и технике безопасности.
  • Женщины-лидеры в STEAM и недостаточно представленных областях — отсюда и экономика!
  • Ресурсы для предприятий и предпринимателей, принадлежащих женщинам.

К ВДОХНОВЛЯЙТЕ женщин и девочек, чтобы они прокладывали свой собственный путь (предоставляя им широкий спектр образцов для подражания, чтобы они могли вдохновиться).

Целевой аудиторией дня были девушки младших и старших классов средней школы, а также женщины со всего Коннектикута. Всего в мероприятии приняли участие 300 человек, половина из них — девочки старшего школьного возраста. И д-р Смирнова, и д-р Чен были рады поделиться с присутствующими своей любовью к экономике. Мероприятие было полезным для всех!

Программа «Экономика раннего обучения в колледже» (https://ece. uconn.edu/) этой осенью провел свой ежегодный семинар для 30 учителей экономики средней школы Коннектикута, которые преподают принципы микроэкономики Университета Коннектикута (ECON 1201), принципы макроэкономики (ECON 1202) и/или основы экономики (ECON 1000).

Ведущим семинара был профессор Майк Шор, представивший «Патентную задержку», в которой он объяснил пределы монопольной власти, передаваемой патентами. Дополнительные отношения между патентами и определение цены покупки или лицензирования патентов.Он продолжил объяснять идею задержки патента. Он также предложил участникам семинара классное задание, в ходе которого студенты узнают, как устанавливаются цены на патенты.

Затем последовал доклад профессора Натальи Смирновой «Использование данных в классе: база данных FRED». Профессор Смирнова продемонстрировала несколько эмпирических применений базы данных FRED Федерального резервного банка Сент-Луиса, включая макроэкономические и микроэкономические примеры.

Профессор Уильям Алперт представил во время обеда доклад об «Опасностях и ловушках предсказаний», в котором были освещены предсказания Пауля Эрлиха о голоде на 1980 год (умирают сотни миллионов человек) и несостоявшиеся предсказания The Clu b Рима от 1973 года. .Профессор Альперт также «предсказал» рост количества лошадей в Соединенных Штатах до более чем 600 миллионов, если тенденции 18 го века сохранятся, при условии отсутствия альтернативных средств передвижения.

Затем профессор Стивен Ланца выступил с презентацией под названием «Открывая заново утраченное искусство: индексы экономических показателей», в которой он подчеркнул важность индексов и предвзятости в этих числах. Он также продемонстрировал, как их рассчитать, используя данные, к которым легко получить доступ.

Профессор Нишит Пракаш представил заключительную презентацию, касающуюся естественного эксперимента, связанного с преследованием. В Индии 79% женщин, живущих в городах, подвергались домогательствам в общественных местах. Профессор Пракаш и его соавторы намеревались определить влияние уличного патрулирования, направленного против домогательств, на тип и частоту инцидентов и активную реакцию женщин. Они также пытаются определить последствия преследований лиц, виновных в домогательствах, и что движет этими изменениями — видимость и / или количество целенаправленной рабочей группы?

Все презентации были хорошо приняты, и семинар был одним из самых успешных, предложенных программой ECE Economics.

Перейти к акварели | Екатерина Смирнова

Стенограммы

1. Начните с акварели!: Привет. Меня зовут хороший город. Хватит, сказал Абдулла. И я испеченный художник в Нью-Йорке. Возможно, вы знаете меня по цветам канала YouTube, которыми сегодня я собираюсь поделиться с вами своими полями. Я познакомлю вас с основными акварельными материалами, такими как бумага, различные виды кистей. Мы изготовим палитру из имеющихся у вас цветов.Я объясню вам правила различных вариантов перспективы и объясню основы света и тени. Мы поговорим об однотонных картинах, а в конце вместе выполним пошаговую акварельную картину. Какого цвета красивая я? Я считаю, что лучше всего просто наслаждаться, расслабляться, выпить чашечку чая, послушать хорошую музыку, и так что вперед, собирай и катайся, и давайте начнем. 2. Акварельные краски: какого цвета краски. Позвольте мне показать вам кое-что, что я ношу с собой очень часто.Это портативная таблетка с акварельной краской, в твердой форме все колористы на вкус. Вы называете их Пенс. Когда я нахожусь в студии, лучше всего работать с чем-то более жидким. И в этом случае я использую какой цвет в выборе мармелад бывает разных размеров от крошечных до очень больших. Позвольте мне дать вам простой от того, какой цвет от того, чтобы просто надавить на них. В этом случае мясная торговля, которую я нашел очень полезной, и использование воды, вам нужно разбавить краску, которая поступает в кастрюлю, что может занять некоторое время, пока вы также из красителя не станет водой.Переносные бюллетени обычно поставляются с отдельной секцией для смешивания ошейника, и позвольте мне показать вам тот же цвет, который получился из двух. Вы можете увидеть, насколько проще и интенсивнее ISS колледжа, и что также рекомендовал бы использовать профессиональный отличный лучевой луч. 3. Акварельная бумага: познакомьтесь с акварельной бумагой. Есть три основных писателя с бумаги. Один из них – горячий пресс. Это действительно гладко. Другой — Gold Press и Ruff Ruff — самые текстурные люди. Давайте посмотрим, как мы можем увидеть разницу между разными типами людей? Моя кисть твердая, ломкая, плоская.Как? Окуните его в воду и соберите одинаковое количество краски для каждого штриха. Я набрала генеральское количество краски на кисть и, просто проведя ею по бумаге, получила ту же силу. Делайте онлайн каждый раз, когда вы чувствуете, что Россия была ошейником, и вы уже можете увидеть разницу между бумагой. Этот Моисей, ммм, горячая пресса на холодном прессе, а большинство структур на крыше. Я лично предпочитаю работать на черновой бумаге. Это позволяет мне добиться более забавных эффектов 4.Кисти для акварели: какого цвета кисти. Есть несколько разновидностей кистей, которые я люблю использовать. Обычно популярно использовать щетку с мягкой щетиной. Они бывают разных размеров. Щетка с грубой щетиной обычно делается из большого ворса. Он гораздо более жесткий и обычно используется для акрила или масла. Но мне нравится использовать их и для водяного воротника, и эта щетка называется хоккейной. Он также очень мягкий и отлично подходит для нанесения воды на бумагу. Щетка обычная. Различные размеры. Это тоже гигантская хоккейная щетка.И просто чтобы дать вам сравнение размеров и посмотреть на это, это совсем другой размер, но оба они — благодарная акварель. 5. Виды перспективы: Поговорим о перспективе. Во-первых, я определяю линию горизонта. Самый простой тип перспективы — это перспектива с одной точкой, и давайте обнаружим, что перспектива с одной точкой и одной точкой — это метод рисования, который показывает, как объекты кажутся уменьшающимися по мере их удаления до точки схода с линией горизонта. Это способ отрисовки объектов, чтобы они казались трехмерными. Я нарисую на бумаге несколько кубиков, и все они будут расположены в разных местах относительно точки. Если я рисую кубы, передняя часть куба всегда остается квадратной, а наука вне куба будет меняться. Актуально по делу. Второй, наиболее распространенный тип перспективы — двухточечная перспектива. Это более правильная перспектива, в которой параллельные линии, проходящие вдоль недель и смертей, часто возражающих, представлены как встречающиеся в двух разных точках на горизонте.Теперь, когда я рисую те же самые кубы, они будут выглядеть немного иначе, чем в предыдущей перспективе. Важно понимать основные правила перспективы, потому что это поможет вам сделать ваши рисунки и картины намного сильнее. Это даст вам представление о трехмерности ваших рисунков и о том, кто сделает вас сильнее как художника. Если вы знаете, как нарисовать куб, вы будете знать, как нарисовать дом. Это пример одноточечной перспективы. Похоже, что на пригородной улице было несколько домов и несколько деревьев.Вы можете видеть, что дорога исчезает далеко за горизонтом. Я собираюсь нарисовать несколько деревьев, которые также следуют направлению перспективы. А чем дальше деревья удаляются, то здесь их становится намного меньше, несколько гор, и после того, как вы закончите рисовать и следовать линиям перспективы, вы всегда сможете стереть их ластиком. 6. Свет и тень: свет и тени. Теперь давайте найдем источник выключения света. Предположим, что свет идет с этого направления.Только с помощью какого цвета? Давайте попробуем создать тени и свет от этих кубов, чтобы они выглядели еще более трехмерными. Таким образом, сторона от кия, которая является абсолютно противоположной положению от источника света, будет в тени. Вот почему я буду использовать самый темный тон синего цвета и наоборот. Место, расположенное ближе к источнику света, будет намного светлее. Если он обращен прямо, он должен быть белым. Хорошо попрактиковаться на простых объектах, таких как Q, потому что, когда вы будете работать с объектами более сложной формы, вы поймете основы света и тени. В этом примере я использую только один цвет, но на самом деле у объектов будут гораздо более сложные тени на источниках света. Хорошо потренироваться на чем-то простом 7. Монохроматический пейзаж: Работая над монохромным пейзажем, я хочу представить вам очень короткое видео о картине, которую я нарисовал, используя только однотонные воротнички. Конечно, можно было использовать всего один цвет и разбавлять водой, но в этом случае выбираются три воротничка из теплой палитры. Это коричневая материя Розианы, а я черный в этом радио, я рисую пейзаж Рио.Работа с монохромными картинами поможет вам понять значения светлого и темного, намного проще, чем полноцветные картины с полным цветом. Гораздо труднее понять глубину тени или яркость света при монохроматике. Это довольно просто. Вы получаете самый глубокий, самый темный цвет для тени и самый светлый. Очень хорошо. Значение цвета для света. Для других ссылок на хорошие примеры монохроматических произведений искусства я хотел бы, чтобы вы взглянули на китайские картины, сделанные черными чернилами на рисовых людях, для которых полный эпизод о том, как сделать этот пейзаж, пожалуйста, посетите мой канал YouTube. 8.Skillshare ekaterina smirnova пошаговый пейзаж: Это пошаговый мастер-класс от вас. Продолжайте собрание о том, как рисовать горы в сумерках. Я выбрал мягкую кисть с заостренным кончиком колориста. Есть ли у Росси когда-либо розовые материи по-французски, которые являются морскими и красочными? Здорово. Вы бы начали с смачивания бумаги. Они хорошо удостоверяются, что это абсолютно то, что все это позволит вашим цветам распространяться очень легко. Я бы начал с Розовой Материи, Рози и цветов, чтобы сделать первый слой сумеречного неба.Определимся с линией горизонта. Это важная строка, о которой всегда следует помнить, когда вы создаете ландшафт, начиная с строки CMA. Примените ее. Смоллс Ли по всему району от этого парня. Так как бумага влажная, расправить воротник очень легко. Этот участок находится под линией горизонта, и это отражение от реки, которое вы можете увидеть в моем улове Littles. Смешивание розианы с розовым веществом создаст автомобиль оранжевого цвета, поэтому они также характеризовали его на любом закате. Не забудьте также сделать отражение от реки.Имейте в виду, что когда краска высохнет, она немного потускнеет, поэтому не бойтесь делать ее немного ярче, чем вы думаете, что она должна быть окрашена. Очень хорошо почистите щетку и ввели новый ошейник, французский или химеринский. Я использую этот красивый цвет, чтобы нарисовать несколько облаков на закате. Что ж, давайте начнем с применения его в верхней части области неба. Важно продолжать делать этот шаг, пока бумага еще влажная. Если вы чувствуете, что бумага высыхает, возможно, вам следует дать ей полностью впитаться, а затем снова намочить ее и продолжить работу.Взяв смесь из French Churchill Marine и Rose Matter, я начну формировать группы облаков. Избиение облаков — это весело, но не так просто. Это потребует некоторой практики. Не бойся. Если вы не уверены, вы делаете красивые облака с самого начала. Возможно, вам стоит попрактиковаться с другой бумагой, а вот наш самый темный ошейник. Старые вещи отличные. Я смешаю этот цвет с французским морем. Это немного темнее, и это означает, что некоторые тени от облаков. Облака не плоские. У объектов есть свет и тени.Я ускорю запись, чтобы вы могли видеть, как развивается процесс. Я бы сказал, что мне требуется около половины Кнауэра, чтобы приветствовать полную картину. Это видео намного короче, но вы можете остановить его и завершить шаг. Вы можете видеть, что я чередую розовый и черный цвета, чтобы сделать облака более широкими в воротнике. Следующий шаг. Дайте ему полностью высохнуть. Когда бумага полностью высохнет. Мы продолжим рисовать горы, и я выбираю французский или немецкий морской чистый цвет и хорошо обманываюсь.Чтобы создать самый дальний слой от гор, используйте свое воображение, чтобы создать интересную форму. Создание речных путей также является частью этого шага. С точки зрения перспективы появится река. Это небольшая линия дальше и намного шире по мере приближения к зрителю. Вы можете использовать более темную цветовую смесь от боли и французского ретро-марина, чтобы бобы были на переднем плане, э-э, и снова дайте бумаге полностью высохнуть для следующих слоев. Второй спуск с гор. Я немного более интенсивный, чем предыдущий, на этот раз я смешиваю боли.Оцените палец на французском, ультра морском и для гала переднего плана и используйте более темный вызывающий через интенсивный, затем для более дальних гор, потому что эта область, которая находится ближе всего к вам, выглядит как в самой темноте в самой тени. Используя точку на моей кисти, я нарисую несколько деревьев на переднем плане. Следующий шаг уже вам знаком. Вы должны дать бумаге высохнуть, когда она полностью высохнет. Повторите предыдущий шаг. Считайте последний слой с дальних гор более интенсивным ошейником. Добавьте более темный цвет для кончиков гор, пока они еще влажные, чтобы сделать эффект более драматичным.Используя самые темные цвета воротника, начните придавать форму деревьям, которые видны на переднем плане. Объекты, которые находятся ближе к вам, раскроют больше деталей. Вот почему в горах на заднем плане не так много деревьев. Тщеславие там, наверху, очень далеко, и мой последний штрих — это наш рекламный свет, окрашиваемый в реку, чтобы сделать его немного более трехмерным, немного от отражения от берега реки. Конечно, вы можете сколько угодно продолжать работать над этой картиной, но вы должны помнить, что меньше значит больше.Надеюсь, вам понравился этот урок. Есть еще много учебников. У вас может быть много интересного на моем канале YouTube, и я также постараюсь сделать больше на обмене навыками. Пожалуйста, посетите мой сайт. Вы могли бы увидеть Джину Смирнову, которая придет и запечатает в следующий раз.

Тест на пригодность Колмогорова-Смирнова

Допущение нормальности > Критерий Колмогорова-Смирнова

Содержимое:

  1. Что такое тест Колмогорова-Смирнова?
  2. Как запустить тест вручную
  3. Использование программного обеспечения
  4. Таблица P-значения теста K-S
  5. Преимущества и недостатки
  6. Распределение Колмогорова-Смирнова

Что такое критерий Колмогорова-Смирнова?

Критерий согласия Колмогорова-Смирнова (тест K-S) сравнивает ваши данные с известным распределением и позволяет узнать, имеют ли они такое же распределение. Хотя тест является непараметрическим — он не предполагает какого-либо конкретного базового распределения — он обычно используется в качестве теста на нормальность, чтобы увидеть, нормально ли распределены ваши данные. Он также используется для проверки предположения о нормальности в дисперсионном анализе.

Более конкретно, тест сравнивает известное гипотетическое распределение вероятностей (например, нормальное распределение) с распределением, созданным вашими данными — эмпирической функцией распределения.

Тест Лиллиефорса, скорректированная версия теста K-S на нормальность , обычно дает более точную аппроксимацию распределения тестовой статистики.На самом деле, многие статистические пакеты (например, SPSS) объединяют эти два теста в качестве «скорректированного по Лиллифорсу» теста K-S.

Примечание: Если вы никогда раньше не сравнивали экспериментальный дистрибутив с гипотетическим дистрибутивом, вы можете сначала прочитать статью об эмпирическом дистрибутиве. Это короткая статья, в которой есть пример простого сравнения двух наборов данных — с использованием точечной диаграммы вместо проверки гипотезы.
Вернуться к началу

Как запустить тест вручную

Нужна помощь с шагами? Посетите нашу обучающую страницу!

гипотез для теста:

То есть
H 0 : P = P 0 , H 1 : P ≠ P 0 .
Где P — это распределение вашего образца (т. е. EDF), а P 0 — заданное распределение.


Общие шаги

Общие шаги для запуска теста :


  1. Создайте EDF для ваших выборочных данных (см. Функция эмпирического распределения для шагов),
  2. Укажите родительский дистрибутив (то есть тот, с которым вы хотите сравнить свой EDF),
  3. Постройте график двух распределений вместе.
  4. Измерьте наибольшее расстояние по вертикали между двумя графиками.
  5. Рассчитать статистику теста.
  6. Найдите критическое значение в таблице KS.
  7. Сравните с критическим значением.

Расчет статистики теста

Статистика теста K-S измеряет наибольшее расстояние между данными EDF F (x) и теоретической функцией F 0 (x), измеренное в вертикальном направлении (цит. по Колмогорову, Стивенс, 1992). Статистика теста определяется как:

Где (для двустороннего теста):

Для одностороннего теста опустите абсолютные значения из формулы.

Если D больше критического значения, нулевая гипотеза отклоняется. Критические значения для D указаны в таблице P-значений теста KS.

Наверх

Пример

Шаг 1: Найдите EDF. В статье о EDF я создал EDF с помощью Excel, который я буду использовать в этом примере.

Шаг 2: Укажите родительский дистрибутив. В той же статье я также рассчитал соответствующие значения для гамма-функции.

Шаг 3: Постройте график функций вместе. Снимок точечной диаграммы выглядел так:

Наибольшее вертикальное расстояние для этого графика выделено желтым прямоугольником.

Шаг 4: Измерьте наибольшее расстояние по вертикали. Предположим, что я изобразил всю выборку в виде графика, и наибольшее расстояние по вертикали, разделяющее мои два графика, равно 0,04 (выделено желтым цветом).

Шаг 5: Найдите критическое значение в таблице K-S. В моей выборке 50 наблюдений. На уровне альфа.05 значение таблицы K-S равно 0,190.

Шаг 6: Сравните результаты шагов 4 и 5. Поскольку 0,04 меньше 0,190, принимается нулевая гипотеза (о том, что распределения одинаковы).

Использование технологии

Большинство программных пакетов могут выполнять этот тест.

R-функция ecdf создает эмпирические функции распределения. Функция R p , за которой следует имя распределения (pnorm, pbinom и т. д.), дает теоретическую функцию распределения.

Доступно несколько онлайн-калькуляторов, например этот и этот.

В результате использования программного обеспечения для проверки нормальности небольшие значения p в ваших выходных данных обычно указывают на то, что данные не относятся к нормальному распределению (Ruppert, 2004).
Вернуться к началу

Таблица P-значения теста K-S

Наверх

Преимущества и недостатки

Преимущества:

  • Тест бесплатное распространение .Это означает, что вам не нужно знать базовое распределение населения для ваших данных перед запуском этого теста.
  • Показатель D (не путать с D Коэна), используемый для теста, легко вычислить.
  • Его можно использовать в качестве критерия согласия после регрессионного анализа.
  • Есть нет ограничений на размер выборки ; Допустимы небольшие образцы.
  • Таблицы легко доступны.

Хотя тест K-S имеет много преимуществ, он также имеет несколько ограничений :

  • Для того, чтобы тест работал, необходимо указать параметры местоположения, масштаба и формы. Если эти параметры оцениваются по данным, тест становится недействительным . Если вы не знаете эти параметры, вы можете провести менее формальный тест (например, описанный в статье об эмпирической функции распределения ).
  • Как правило, нельзя использовать для дискретных дистрибутивов, , особенно если вы используете программное обеспечение (большинство программных пакетов не имеют необходимых расширений для дискретного теста K-S, а ручные вычисления запутаны).
  • Чувствительность выше в центре распределения и ниже на хвостах.

Наверх

Термин «Распределение Колмогорова-Смирнова» относится к распределению статистики K-S. В подавляющем большинстве случаев предполагается, что основная кумулятивная функция распределения является непрерывной. В этих случаях распределение K-S может быть глобально аппроксимировано общим бета-распределением [1].

Однако для некоторых реальных приложений требуется дискретное распределение.Хотя можно подобрать дискретное распределение, работа с разрывами скачков была проблематичной. На самом деле не существует общепринятых эффективных или точных вычислительных методов, позволяющих справиться с этой ситуацией. Димитрова и др. al [2] предоставил один метод для прерывистого распределения Колмогорова-Смирнова; это приводит к точным значениям p для теста. Этот подход выходит за рамки этой статьи, но включает в себя выражение дополнительной PDF через вероятность прямоугольника для равномерной статистики порядка с помощью быстрого преобразования Фурье.

Случайная величина K-S D n с параметром n имеет кумулятивную функцию распределения D n −1/(2n) из [3]:

Колмогоров-Смирнов Распределение: Литература

[1] Чжан, Дж. и Ву, Ю. (2001). Бета-аппроксимация распределения статистики Колмогорова-Смирнова. Аня. Инст. Статистическая математика. Том 54. № 3, 577-584. Получено 1 ноября 2021 г. с: https://www.ism.ac.jp/editsec/aism/pdf/054_3_0577.pdf
[2] Димитрова, Д.и другие. (2020). Вычисление распределения Колмогорова-Смирнова, когда лежащий в основе CDF является чисто дискретным, смешанным или непрерывным. Журнал статистического программного обеспечения. Том 95, выпуск 10 (октябрь). КС.
[3] Распределение Колмогорова–Смирнова. Получено 15 ноября 2021 г. с: http://www.math.wm.edu/~leemis/chart/UDR/PDFs/Kolmogorovsmirnov.pdf

.

Связанные статьи

Ссылки

Чакраварти, Лаха и Рой (1967). Справочник по методам прикладной статистики, том I, John Wiley and Sons, стр.392-394.
Рупперт, Д. (2004). Статистика и финансы: введение. Springer Science and Business Media.
Стивенс М.А. (1992) Введение в Колмогорова (1933) Об эмпирическом определении распределения. В: Коц С. , Джонсон Н.Л. (ред.) Прорывы в статистике. Серия Springer в статистике (Перспективы в статистике). Спрингер, Нью-Йорк, NY

————————————————— ————————-

Нужна помощь с домашним заданием или контрольным вопросом? С Chegg Study вы можете получить пошаговые ответы на свои вопросы от эксперта в данной области.Ваши первые 30 минут с репетитором Chegg бесплатны!

Комментарии? Нужно опубликовать исправление? Пожалуйста, оставьте комментарий на нашей странице Facebook .


Переходные конформеры LacY захватываются нанотелами

Значение

Для получения стабильных конформеров множественных интермедиатов в транспортном цикле пермеазы лактозы Escherichia coli (LacY) мы используем одноцепочечные нанотела (Nbs) верблюдовых, которые размером ~15 кДа и имеют уникальную структуру с гибкими антигенсвязывающими петлями, которые могут вставляться в расщелины и полости. Сайт-направленное, зависящее от расстояния тушение/негашение флуоресцентных зондов на противоположных поверхностях LacY используется уникальным способом для оценки конформеров LacY, захваченных Nbs, которые связываются исключительно с периплазматической стороной и блокируют транспорт с повышенной доступностью сайта связывания сахара. . Исследования убедительно документируют чередующийся механизм доступа для транспорта и предоставляют доказательства того, что Nbs стабилизируют несколько различных конформаций LacY с открытыми периплазматическими связями, тем самым обеспечивая новый общий подход к изучению структуры и функции мембранных белков.

Abstract

Пермеаза лактозы Escherichia coli (LacY), высокодинамичный мембранный белок, катализирует симпорт галактопиранозида и H + с использованием механизма альтернативного доступа, а транспортный цикл включает несколько конформационных состояний. Однодоменные нанотела верблюдовых (Nbs), разработанные против мутанта LacY, иммобилизованного во внешней (периплазматической) открытой конформации, связываются с гибким белком WT и стабилизируют открытую наружу конформацию (конформации). Здесь мы используем сайт-направленное, зависящее от расстояния тушение/негашение Trp флуоресцентных зондов, вставленных на противоположные поверхности LacY, для оценки конформационных состояний белка в комплексе с каждым из восьми уникальных Nb, которые связываются исключительно с периплазматической стороной и блокируют транспорт. но увеличить доступность сайта связывания сахара. Связывание Nb включает конформационный отбор молекул LacY с экспонированными связывающими эпитопами. Каждый из восьми Nbs индуцирует тушение тремя парами цитоплазматических зондов Trp/флюорофор, указывая на закрытие цитоплазматической полости.Взаимным образом те же Nbs индуцируют нетушение флуоресценции в трех парах периплазматических зондов за счет открытия периплазматической полости. Поскольку степень изменения флуоресценции с различными Nbs различается, и различия коррелируют с изменениями в скорости связывания сахара, также делается вывод, что Nbs стабилизируют несколько различных открытых наружу конформаций LacY.

Симпорт лактозы и H + через мембрану катализируется пермеазой лактозы Escherichia coli (LacY) по механизму чередующегося доступа с использованием реципрокного открытия и закрытия глубоких заполненных водой полостей на периплазматической и цитоплазматической сторонах мембраны. белок.Таким образом, сайты связывания сахара и H + открываются с любой стороны мембраны, не обеспечивая непрерывного пути. Общий транспортный цикл включает несколько состояний, которые включают конформеры с открытыми наружу или внутрь полостями и закрытыми промежуточными соединениями (1). LacY очень динамичен с распределением конформационных промежуточных соединений. Было решено несколько рентгеновских структур LacY в обращенной внутрь конформации с плотно закрытой периплазматической стороной (2⇓⇓–5). Совсем недавно сообщалось об узко открытой наружу конформации с закрытыми галактозидами и плотно закрытой цитоплазматической стороной (6, 7).Измерения расстояний с использованием сайт-направленных мутантов LacY, меченных двойным нитроксидом, демонстрируют присутствие нескольких интермедиатов, распределение которых изменяется за счет связывания сахара, что сдвигает равновесие в сторону периплазматических открытых форм (8, 9). Однако структура каждого интермедиата и детали переходов во время транспортного цикла неясны. Поэтому стабилизация промежуточных состояний критически важна для понимания парциальных реакций в общем транспортном цикле.Использование однодоменных нанотел (Nbs) верблюдовых для улавливания специфических конформационных состояний рецепторов, связанных с G-белком, привело к значительному прогрессу в понимании их механизмов (10⇓⇓⇓–14). Небольшой размер Nbs и уникальная способность стабилизировать промежуточные состояния гибких белков путем введения антиген-специфических связывающих петель в щели и полости чрезвычайно ценны для захвата различных конформеров белков.

Недавно мы сообщили о разработке Nbs, которые специфически связываются с периплазматической стороной LacY и улавливают открытые наружу конформации (15).Nbs были приготовлены против двойного Trp-мутанта LacY G46W/G262W, воссозданного в протеолипосомы, где белок ориентирован периплазматической стороной наружу, как в бактериальной мембране, так что периплазматические эпитопы экспонированы. Очищенные Nbs связываются с наномолярной или субнаномолярной аффинностью с периплазматической поверхностью WT LacY и инактивируют транспорт лактозы. Однако сайт связывания сахара в комплексах LacY/Nb становится намного более доступным для галактозидов (с увеличением значений k на значений для связывания сахара до 50 раз), что указывает на стабилизацию открытой наружу конформации (конформаций).Кроме того, открытие периплазматической полости в конформере, стабилизированном Nb, было продемонстрировано путем негашения биман-меченого Cys/Trp двойного мутанта F29W/G262C на периплазматической стороне LacY. Тушение флуоресценции бимана с помощью Trp было описано в лизоциме Т4, когда расстояния между атомами Cα меченных биманом остатков Cys и Trp находятся в пределах 7–11 Å (16). Негашение меченого биманом Cys262 в комплексе LacY/Nb9036 происходит за счет отделения бимана от тушителя (Trp29), что четко указывает на открытие периплазматической полости.Более того, скорости расщепления бимана и связывания Nb9036, измеренные непосредственно, идентичны (значение k на составляет 0,4 мкМ -1 ⋅с -1 в обоих случаях). Таким образом, Nb взаимодействует с существующим открытым наружу конформером LacY и стабилизирует структуру, а не вызывает конформационные изменения, что предполагает связывание путем конформационного отбора.

В этой статье мы сообщаем о влиянии восьми уникальных Nbs на общую конформацию LacY. Каждый из Nbs связывается с периплазматической стороной WT LacY и полностью блокирует активный транспорт из-за стабилизации специфических конформеров с повышенной доступностью сайта связывания сахара (15).Конформационные состояния комплексов LacY/Nb исследовали с помощью направленного, зависящего от расстояния Trp-индуцированного тушения флуорофоров (16) у мутантов LacY с парными меченными флуорофором остатками Cys и Trp, расположенными на цитоплазматической или периплазматической поверхности LacY. Тушение с тремя цитоплазматическими парами и нетушение с тремя периплазматическими парами наблюдаются в комплексах LacY/Nb, тем самым расширяя вывод о том, что Nbs стабилизируют конформеры, в которых периплазматическая полость открыта, а цитоплазматическая полость закрыта. Более того, величина изменений флуоресценции отличается для разных Nbs и коррелирует с изменениями скорости связывания сахара, тем самым указывая на то, что Nbs стабилизируют несколько различных открытых наружу конформеров LacY.

Результаты

Bimane-меченые пары Cys-Trp, введенные с противоположных сторон LacY, чувствительны к закрытию/открытию цитоплазматических и периплазматических полостей, вызванных связыванием или диссоциацией сахара, как показано гашением/негашением флуоресцентных зондов (17).Более того, скорости конформационных изменений измеряли с помощью остановки потока с использованием Trp-индуцированного тушения/негашения флуоресценции бимана, расположенного по обе стороны от LacY (17). Тестирование меченных bimane или ATTO655 мутантов на влияние связывания Nb на флуоресценцию привело к выбору трех цитоплазматических (R135C/V343W, N137C/F334W и F140W/V343C) и трех периплазматических (I32C/N245W, K42C/F378W, и F29W/G262C) для детального анализа. У каждого мутанта вставленный Trp находится в N-концевом пучке из шести спиралей, а меченый Cys находится в С-концевом пучке из шести спиралей, или наоборот (т. д., флуорофор и тушитель располагаются по разные стороны цитоплазматической или периплазматической полостей). В рентгенограммах LacY Cα-Cα расстояния между цитоплазматическими остатками 135/343 (спираль IV/петля 10–11), 137/334 (петля 4–5/спираль X) и 140/334 (спираль V/ петли 10–11) составляют 25,1, 25 и 22,5 Å в открытой внутрь структуре и 12,4, 15,7 и 14,8 Å в открытой наружу структуре соответственно. Расстояния Cα-Cα между периплазматическими остатками 32/245 (спираль I/спираль VII), 42/378 (спираль II/петля 11–12) и 29/262 (спираль I/спираль VIII) равны 6.2, 9,1 и 8,1 Å в открытой внутрь структуре и 12,4, 18,1 и 10,4 Å в открытой наружу структуре соответственно. Таким образом, значительные изменения расстояния происходят во время перехода от открытой внутрь к открытой наружу конформации, которые находятся в диапазоне, подходящем для измерений с помощью Trp-индуцированного тушения/негашения флуорофора (17).

Закрытие цитоплазматической полости.

LacY очень динамичен и имеет несколько конформаций. Следовательно, Nb-связывающие эпитопы LacY дикого типа всегда доступны во фракции конформеров с открытой периплазматической полостью.Однако взаимодействие Nbs с мутантами может быть изменено вставкой объемных остатков Trp и мечением флуорофорами, которые могут изменить конформационное распределение. Поэтому действие Nb9063 тестировали в отсутствие и в присутствии сахара, который смещает равновесие в сторону конформеров с открытыми периплазматическими и закрытыми цитоплазматическими полостями (18).

В отсутствие сахара индуцированное Trp тушение флуоресценции бимана после добавления Nb9063 проявляется только у мутанта 135C/343W, а при использовании пары 137C/334W или 140W/343C эффект не наблюдается (рис.1). Однако последующее добавление p -нитрофенил-α-d-галактопиранозида (NPG) приводит к быстрому падению флуоресценции бимана с последующим более медленным снижением. Кроме того, связывание β-d-галактопиранозил-1-тио-β-d-галактопиранозида (TDG) вызывает тот же эффект (рис. S1). Nbs 9055 и 9036 демонстрируют аналогичные результаты (рис. S2) – тушение бимана парой 135C/343W, но не влияет на пару 137C/334W в отсутствие сахара. Добавление NPG перед Nb приводит к различной степени тушения флуоресценции для каждого мутанта (15% для 135C/343W и ​​10% для 137C/334W), но общая величина тушения не зависит от порядка добавления сахара и Nb (ср. зеленые и серые следы на рис.С2).

Рис. 1.

Влияние сахара на взаимодействие Nb с мутантами LacY. Структурные модели конформеров, обращенных внутрь и наружу, если смотреть с цитоплазматической стороны (идентификационные коды PDB 2CFQ и 4OAA вверху слева и справа, соответственно), показаны с радужным цветом основной цепи (от синего до красного для спиралей с I по XII соответственно). Остатки, замещенные сайт-направленным мутагенезом, представлены в виде сфер. Временные графики изменения флуоресценции с тремя меченными биманом цитоплазматическими мутантами 137C/334W, 140W/343C и 135C/343W были зарегистрированы после добавления Nb9063 (красная стрелка) с последующим добавлением NPG (черная стрелка). Подгонки с одной экспонентой показаны красными линиями.

Рис. S1.

Сходный эффект двух галактозидов на взаимодействие Nbs с меченым биманом 140W/343C LacY. Изменение флуоресценции бимана во времени демонстрирует эффекты NPG ( A ) или TDG ( B ), добавленных до или после добавления Nbs 9063 и 9048, как указано. Стрелки указывают добавки Nb, NPG или TDG (красный, синий или черный цвет соответственно). Подгонки с одной экспонентой показаны черными линиями. Изменения флуоресценции бимана (как Δ F / F 0 в %) даны для отдельных эффектов галактозидов и для общего эффекта Nb плюс сахар в конце кривой.

Рис. S2.

Влияние NPG и Nb на цитоплазматические меченные биманом мутанты 135C/343W ( A–C ) и 137C/334W ( D–F ). Рисунки в верхней части иллюстрируют расположение атомов Cα введенного Trp (красные сферы) и меченого биманом Cys (синие сферы) для каждой пары Cys-Trp в конформации, обращенной внутрь (вид сбоку с отмеченными N- и C-концевыми шестью). — спиральные пучки). Структурные модели данных Nbs показаны на Right . График изменения флуоресценции бимана показан для пар Cys-Trp при добавлении Nb первым (верхние зеленые линии) или при добавлении сахара первым (нижние серые линии).Добавление 300 нМ Nb или 0,1 мМ NPG к 100 нМ меченных биманом мутантов LacY указано красными или черными стрелками соответственно. Изменения флуоресценции бимана (как Δ F / F 0 в %) даны для отдельных эффектов и для общего эффекта Nb плюс сахар в конце кривой.

Следовательно, у мутантов 137C/334W и 140W/343C периплазматические эпитопы для Nb недоступны в отсутствие субстрата, но после связывания галактозида происходит конформационное изменение и эпитопы становятся доступными.Возможно, вставка объемных остатков Trp (140W или 334W) в области тесного контакта между N- и C-концевыми шестиспиральными пучками на цитоплазматической поверхности LacY (рис. S3) вызывает конформационный сдвиг в сторону цитоплазматически-открытой /периплазматическая-закрытая форма с недоступными периплазматическими эпитопами. Скорость закрытия цитоплазматической полости, вызванная связыванием NPG (4–200 с –1 для различных пар Cys-Trp, меченных биманом, и не зависит от концентрации сахара; ссылка 17), намного выше, чем скорость тушения, вызванная Nb9063. (~0.02 с −1 ; см. красные линии на рис. 1), предполагая, что Nb не вызывает конформационных изменений, а связывается с уже существующим конформером. В любом случае динамическое конформационное равновесие в присутствии галактозида определяет начальный уровень флуоресценции в экспериментах с цитоплазматическими парами Cys-Trp, а тушение флуоресценции после добавления Nb отражает медленное накопление стабилизированных комплексов LacY/Nb.

Рис. S3.

Остатки, участвующие в закрытии цитоплазматической полости.Рентгеновская структура, обращенная наружу (код PDB ID 4OAA), видна с цитоплазматической стороны со спиралями I–XII радужного цвета (от синего до красного) и плотно упакованными остатками Gly64 и Thr348 (спирали II и XI), G141 и Pro280 ( спирали V и VIII), Phe140, Phe334 и Tyr350 (спирали V, X и XI) показаны в виде сфер. Обратите внимание на ароматическую стопку остатков Phe140, Phe334 и Tyr350 в середине.

Закрытие цитоплазматической полости наблюдается в комплексах всех трех меченных флуорофором мутантов Cys-Trp с каждым из восьми Nbs (рис.2). Временные графики изменения флуоресценции окрашены специально для каждого Nb и представлены в одной и той же шкале времени на рис. 2, демонстрируя сходное влияние каждого Nb на все три пары меченых. Так, меченные биманом пары 135C/343W, 137C/334W, 140W/343C и 140W/343C, меченные ATTO655, демонстрируют относительно медленное снижение флуоресценции при связывании Nb; скорость тушения флуоресценции специфична для каждого Nb и увеличивается от Nb9055 до Nb9065 (в пределах от 0,01 до 0,13 с -1 ) с почти идентичными результатами для пары 140W/343C, меченной биманом или ATTO655.Кроме того, с каждым Nb не наблюдается значительных сдвигов в максимуме спектров излучения (рис. S4), а в контрольных экспериментах с мутантами Cys, меченными биманом, в которых отсутствует соответствующий гаситель Trp, не наблюдается снижения флуоресценции после добавления Nbs (рис. S5). Поэтому связанные Nbs практически не вызывают изменения локальной среды вокруг флуорофора. Очевидно, тушение флуоресценции в этих LacY/Nb комплексах является результатом уменьшения расстояния между Trp и флуорофором во всех меченых парах и, следовательно, отражает закрытие цитоплазматической полости.

Рис. 2.

Влияние восьми Nbs на расстояния между мечеными флуорофором остатками Cys и Trp, введенными на цитоплазматической стороне LacY. На рисунках справа показано расположение атомов Cα введенного Trp (красные сферы) и меченных биманом замен Cys (синие сферы) у каждого мутанта в цитоплазматически-открытом конформере, если смотреть со стороны с N- и C-концевой шестиспиральной указаны пучки. Внизу справа для сравнения представлены структуры флуорофоров после реакции с Cys.Динамика тушения флуоресценции в результате добавления Nbs к меченым биманом мутантам 135C/343W ( A ), 137C/334W ( B ) и 140W/343C ( C ) или меченным ATTO655 140W/343C D ) показаны цветными линиями с заданным соответствующим Nb. Следы были записаны в присутствии 0,1 мМ NPG и отображены на той же временной шкале для сравнения. Черные стрелки указывают на добавление Nb. Подгонки с одной экспонентой показаны черными линиями.

Рис. S4.

Trp-индуцированное тушение флуоресценции меченого ATTO655 140W/343C LacY в результате взаимодействия с восемью Nbs.На рисунке вверху показано расположение атомов Cα вставленного Trp140 (красная сфера) и меченного ATTO655 Cys343 (синяя сфера) в конформации LacY, обращенной внутрь (идентификационный код PDB 2CFQ, если смотреть сбоку с N- и C-концевых шести отмечены пучки спирали). Спектры эмиссии регистрировали при длине волны возбуждения 650 нм до (серые линии) и после (цветные линии) добавления каждого Nb (300 нМ) к меченому LacY (120 нМ) в присутствии 0,1 мМ NPG. Стрелки указывают на тушение флуоресценции ATTO с помощью Trp140 в результате закрытия цитоплазматической полости.

Рис. S5.

Взаимодействие Nb с LacY вызывает тушение флуорофора, присоединенного к Cys на цитоплазматической стороне, только при введении дополнительного остатка Trp. На рисунках вверху показано расположение атомов Cα вставленного Trp (красные сферы) и меченного биманом Cys (синие сферы) каждой пары Cys-Trp в конформации, обращенной внутрь (идентификационный код PDB 2CFQ, если смотреть со стороны цитоплазмы). Показана динамика изменения флуоресценции биманов для пар Cys-Trp (серые линии) и для мутантов, лишенных введенного Trp (синие линии): 134C/343W и ​​134C ( A ), 135C/343W и ​​135C ( B ). , 136C/334W и 136C ( C ), 137C/334W, 137C/340Q и 137C ( D ).Следы регистрируют в присутствии 0,1 мМ NPG. Добавление 200 нМ Nb9063 к 80 нМ мутантов LacY, меченных биманом, указано красными стрелками. Подгонки с одной экспонентой показаны красными линиями.

Величина тушения флуоресценции, оцененная по одноэкспоненциальной подгонке, отличается для каждого протестированного Nb. Примечательно, однако, что сравнение нормализованной степени изменения флуоресценции в четырех наборах данных (рис. 2) выявляет аналогичный паттерн тушения, по крайней мере, для шести Nbs (рис. 3).Наибольшее изменение в каждой меченой паре наблюдается со связанными Nbs 9063 (3) или 9048 (4), тогда как другие Nbs проявляют меньшие эффекты. Nbs 9047 (5), 9033 (6) и 9043 (7) демонстрируют одинаковую степень тушения для каждой пары, которая превышает степень тушения 9065 (8). Поскольку степень тушения напрямую зависит от расстояния между флуорофором и тушителем, данные свидетельствуют о наличии различных конформеров по отношению к цитоплазматически замкнутой молекуле LacY в комплексе с разными Nbs.

Рис. 3.

Сравнение степени тушения флуоресценции в комплексах трех меченых цитоплазматических мутантов LacY с восемью Nbs. Величину тушения рассчитывали (как Δ F / F 0 ) по временным характеристикам, показанным на рис. 2, и нормализовали как процент максимального изменения флуоресценции в каждом наборе данных. Степень тушения Trp/флуорофора, индуцированного каждым отдельным Nb в четырех наборах данных, усредняли и представляли в виде гистограммы со стандартными отклонениями. Числа на оси x соответствуют Nbs: 9055 (1), 9036 (2), 9063 (3), 9048 (4), 9047 (5), 9033 (6), 9043 (7) и 9065 (8). ) и имеют цветовую маркировку, как на рис.2.

Вскрытие периплазматической полости.

Связывание галактозида с LacY с парами Cys-Trp, меченными флуорофором, на периплазматической стороне (32C/245W, 42C/378W и 29W/262C) демонстрирует отсутствие тушения флуоресценции из-за открытия периплазматической полости (17). Однако Nbs содержат 2–4 остатка Trp (рис. S6), они связываются с периплазматическими эпитопами на LacY, и флуорофоры, введенные на периплазматической стороне, могут быть достаточно близко к остаткам Trp в Nbs для того, чтобы произошло тушение (15). Поэтому в качестве контроля эффекты связывания Nb сначала тестировали в отсутствие сахара с меченными флуорофором мутантами, лишенными введенного остатка Trp (рис.С6 и С7). Размер и расположение флуорофора, по-видимому, являются важными факторами в отношении способности Nbs изменять флуоресценцию. Таким образом, 32C LacY, меченный маленьким бимановым зондом, проявляет гашение только при связывании Nb9063 (рис. S6 A и C ), тогда как шесть из восьми протестированных Nb гасят меченный ATTO655 мутант (рис. S6 B ). и D ). Различная степень тушения наблюдается у меченного биманом 42C LacY при связывании восьми Nbs, тогда как у меченного биманом 262C LacY только Nbs 9063 и 9048 являются тушителями (рис.С7).

Рис. S6.

Влияние восьми Nbs на флуоресценцию 32C LacY, меченного биманом или ATTO655, в отсутствие встроенного остатка Trp. Структура обращенной наружу конформации LacY (идентификационный код PDB 4OAA) отображается слева в виде остова радужного цвета (от синего до красного для спиралей I – XII) с заменой I32C, показанной в виде сфер. Структурные модели восьми Nbs представлены внизу, где остатки Trp выделены зелеными сферами. Изменение флуоресценции во времени показано для биман- и ATTO655-меченого 32C ( A и B соответственно) в виде цветных линий с указанием соответствующих Nbs. Черные стрелки указывают на добавление трехкратного избытка Nbs к 60 нМ LacY в отсутствие сахара. Одиночные экспоненциальные подгонки показаны черными линиями. Гистограммы демонстрируют степень изменения флуоресценции меченого биманом и ATTO655 32C ( C и D соответственно), представленного в A и B . Числа на оси x соответствуют Nbs: 9055 (1), 9036 (2), 9063 (3), 9048 (4), 9047 (5), 9033 (6), 9043 (7) и 9065 (8). ) и имеют цветовую маркировку, как на рис.2–4.

Рис. S7.

Изменения флуоресценции, вызванные различными Nbs, добавленными к меченым биманом периплазматическим мутантам Cys в отсутствие встроенного остатка Trp. На рисунках слева показано расположение атомов Cα вставленных меченых биманом остатков Cys (синие сферы) в обращенной наружу конформации LacY (идентификационный код PDB 4OAA, вид сбоку с N- и C-концевыми шестиспиральными пучками). отмечено). Изменение флуоресценции бимана во времени показано для 32C ( A ), 42C ( B ) и 262C ( C ) в виде цветных линий с указанием соответствующих Nbs. Черные стрелки указывают на добавление трехкратного избытка Nbs к 60–80 нМ LacY в отсутствие сахара. Одиночные экспоненциальные подгонки показаны черными линиями. Гистограммы на D F демонстрируют степень изменения флуоресценции после связывания восьми Nbs с биман-мечеными 32C ( D ), 42C ( E ) и 262C ( F ), рассчитанную по временным трассам. показано слева. Числа на оси x соответствуют Nbs: 9055 (1), 9036 (2), 9063 (3), 9048 (4), 9047 (5), 9033 (6), 9043 (7) и 9065 (8). ) и имеют цветовую маркировку, как на рис.2–4.

При добавлении Nbs к биман-меченым двойным мутантам 32C/245W, 42C/378W или 29W/262C в большинстве случаев наблюдается нетушение флуоресценции (рис. 4). Изменения флуоресценции, вызванные Nbs, были зарегистрированы в отсутствие сахара и отражают относительно медленное увеличение флуоресценции до различных уровней (рис. 4 A-C ), что указывает на то, что Nb-связывающие эпитопы доступны. Суммарная величина изменения флуоресценции не зависит от порядка добавления сахара и Nb в каждом случае (рис. С8). Скорости тушения аналогичны скоростям тушения, измеренным с помощью цитоплазматических пар (сравните временные шкалы на рис. 2 и 4). Изменения флуоресценции здесь отражают медленное связывание Nbs с доступными эпитопами (скорости варьируются от 0,02 до 0,15 с -1 ) и не отражают скорость конформационных изменений на периплазматической стороне (27-32 с -1 , как определено с помощью пара 32C/245W с маркировкой bimane; ссылка 17). Следовательно, нетушение флуоресценции после добавления Nb связано с медленным связыванием Nb и накоплением стабилизированных комплексов LacY/Nb с периплазматической открытой полостью.

Рис. 4.

Влияние восьми Nbs на расстояния между мечеными биманом остатками Cys и Trp на периплазматической стороне LacY. Структурные модели обращенных внутрь и наружу конформеров (идентификационные коды PDB 2CFQ и 4OAA вверху слева и справа соответственно), рассматриваемые с периплазматической стороны, показаны со спиралями, окрашенными в радужный цвет (от синего до красного для спиралей с I по XII соответственно). Введенные пары Cys-Trp представлены в виде сфер с указанными заменами (красный для Trp, синий для Cys). Динамика не тушения флуоресценции в результате добавления Nbs к биман-меченым мутантам 32C/245W ( A ), 42C/378W ( B ) и 29W/262C ( C ) показаны цветными линиями с соответствующими Nb. указано.Следы были записаны без присутствия сахара и отображены в той же шкале времени, как показано на рис. 2 для сравнения. Черные стрелки указывают на добавление Nb. Подгонки с одной экспонентой показаны черными линиями. Гистограммы D F иллюстрируют величину изменений флуоресценции в результате взаимодействия каждого из восьми Nbs с тремя заданными мутантами LacY. Данные представлены для меченых биманом пар Cys-Trp (красные столбцы, см. следы в A-C ) и контрольных мутантов, лишенных введенного остатка Trp (незаштрихованные синие столбцы, рис.S7): 32C/245W и 32C ( D ), 42C/378W и 42C ( E ), 29W/262C и 262C ( F ). Числа на оси x соответствуют Nbs: 9055 (1), 9036 (2), 9063 (3), 9048 (4), 9047 (5), 9033 (6), 9043 (7) и 9065 (8). ) и цветовой маркировкой, как на рис. 2 и 3.

Рис. S8.

Кумулятивный эффект сахара и Nb, добавленных к периплазматическим биман-меченым мутантам 32C/245W ( A ), 42C/378W ( B ) и 29W/262C ( C и D ). Величина изменения флуоресценции бимана (как Δ F / F 0 в %) дана для отдельных эффектов и для общего эффекта Nb плюс сахар в конце кривой.Добавление 200 нМ Nb, 6 мМ TDG или 0,1 мМ NPG к 80 нМ биман-меченых мутантов LacY указано стрелками.

Сравнение величины изменения флуоресценции в результате взаимодействия восьми Nb с мутантами LacY показывает, что каждый Nb оказывает специфический эффект. В некоторых случаях нетушение флуорофора, указывающее на открытие периплазматической полости, происходит вместе с тушением Trp в Nb (красные и незакрашенные синие столбцы на рис. 4 D F ). Поэтому незакалка частично или полностью маскируется тушащим эффектом Nb.Например, Nb9055 (1) является сильным тушителем бимана, присоединенного к 42C, но не к 32C или 262C (рис. 4 D F , открытая синяя полоса 1). Однако негасящее действие Nb9055 на меченые биманом пары 32C/245W и 29W/262C резко различается (рис. 4 D и F , красные столбцы 1). Тушащий эффект Nbs 9036 (2), 9063 (3) и 9048 (4) на биман-меченый 42C постепенно увеличивается с 3 до 24% (рис. 4 E , незаштрихованные синие столбцы 2–4). Следовательно, нетушащее действие тех же Nbs на соответствующий двойной мутант 42C/378W постепенно снижается с 18 до 5% (рис.4 E , красные столбцы 2–4).

Степень нетушения, наблюдаемая у пары 32C/245W, расположенной в середине периплазматической стороны (спирали I и VII), как правило, больше, чем у двух других пар (ср. оси и на рис. 4 D Ф ). Примечательно, что добавление одного сахара также приводит к большему нетушению в середине периплазматической стороны, чем на периферии молекулы (рис. S8 A, B и D ; эффект TDG составляет 75% по сравнению с 22% и ). 9% для пар 32C/245W, 42C/378W и 29W/262C соответственно).Эти данные, вероятно, отражают большие перемещения спиралей I и VII относительно спиралей на периферии LacY при открытии периплазматической полости.

Поразительно, но связывание сахара с комплексами LacY с различными Nbs приводит к дополнительному расщеплению на периплазматической стороне, что указывает на дальнейшие конформационные изменения. Например, пять Nb, не вызывающих тушения флуоресценции в контрольном мутанте 32C, лишенном вставки Trp (рис. 4 D , незакрашенные синие столбцы), образуют комплексы с 32C/245W LacY, характеризующиеся различной степенью биманового тушения в отсутствие сахара (рис.5 A и B , красные полосы). Последующее добавление TDG увеличивает негашение до максимального уровня, наблюдаемого при использовании только TDG (фиг. 5 B , синие столбцы). Все три периплазматические пары демонстрируют быстрое усиление флуоресценции при добавлении сахара к предварительно образованным комплексам LacY/Nb (рис. 5 и рис. S8 и S9), что указывает на дальнейшее открытие периплазматической полости. Таким образом, связывание Nb в отсутствие сахара стабилизирует обращенные наружу конформеры, которые структурно отличаются от конформеров со связанным сахаром.

Рис. 5.

Дальнейшее вскрытие периплазматической полости после присоединения сахара к комплексам LacY/Nb. ( A ) Динамика изменения флуоресценции в меченном биманом 32C/245W LacY после добавления каждого данного Nb с последующим TDG показана цветными линиями. Стрелки указывают на добавление Nb или TDG. Одноэкспоненциальные аппроксимации представлены черными линиями. ( B ) Гистограмма иллюстрирует степень негашения бимана в комплексах LacY/Nb (красные столбцы) и общее увеличение флуоресценции после связывания TDG (синие столбцы), рассчитанное по отдельным кривым в A .Динамика изменения флуоресценции меченого биманом 32C/245W после добавления только TDG показана на рис. S8 A .

Рис. S9.

Дополнительное открытие периплазматической полости за счет связывания сахара с комплексами LacY/Nb. Динамика изменения флуоресценции 42C/378W LacY, меченного биманом ( A ), или 29W/262C, меченного биманом ( B ) или ATTO655 ( C ), показана в виде цветных линий с обозначенным Nb, добавленным первым (красные стрелки). ), за которым следует сахар (черные стрелки).Гистограммы на D F иллюстрируют степень изменения флуоресценции в меченых биманом 42C/378W ( D ), 29W/262C ( E ) и 29W/262C, меченных ATTO655 ( F 9). после связывания указанных Nbs (красные столбцы) и общее увеличение флуоресценции после связывания TDG с комплексами LacY/Nb (синие столбцы), рассчитанное по временным кривым, показанным слева. Общие изменения флуоресценции в результате добавления сахара с последующим добавлением Nb показаны серыми полосами. График изменения флуоресценции меченных биманом 42C/378W и 29W/262C после добавления только ТДГ показан на рис. S8 B и D . Обратите внимание, что Nb9055 является сильным тушителем бимана, присоединенного к Cys42 (рис. S7 B и E ), а Nb9033 тушит флуоресценцию ATTO при 29 Вт/262°C ( C ).

Диссоциация Nbs из комплексов LacY/Nb.

Количественный анализ степени изменения флуоресценции (рис. 2–5) точен только в том случае, если образование комплексов LacY/Nb близко к 100%. Поскольку используемые концентрации LacY были низкими (80–100 нМ при трехкратном избытке Nbs), сродство Nbs к LacY становится критическим. K d значения для Nbs 9055, 9036 и 9063, равные 2,8, 0,6 и 0,9 нМ соответственно, были определены путем тушения флуоресценции биман- и ATTO655-меченого 32C LacY без встроенного остатка Trp (15). Здесь аффинность Nbs оценивали путем конкурентного связывания Nb9063 с ATTO655-меченым 32C LacY, предварительно инкубированным отдельно с каждым Nb. Большой гасящий эффект Nb9063 (рис. 6 и рис. S6 B и D ) позволяет определить скорость диссоциации других Nbs из комплексов LacY путем замещения избытком Nb9063. Скорость связывания Nb9063 только с LacY оценивается в этих экспериментальных условиях как 0,13 с -1 (фиг. 6, нижняя линия). Nb9063, добавленный к комплексу LacY/Nb, связывается только после диссоциации связанного Nb. Уменьшение флуоресценции АТТО наблюдается потому, что другие Nb тушат АТТО в меньшей степени (рис. S6 B и D ). Скорости вытеснения соответствуют константам скорости диссоциации ( к от ) высвобожденных Nbs и варьируются от 7 × 10 -4 до 1.7 × 10 –2 ⋅с –1 (табл. 1). Эти данные показывают, что аффинность каждого Nb довольно высока со значениями K d менее 10 нМ, поскольку значения k на обычно составляют приблизительно 1 мкМ -1 ⋅с -1 (12 ), что хорошо согласуется с ранее измеренными значениями для Nbs 9055, 9036, 9063 и 9047 (табл. 1). Таким образом, образование комплексов LacY/Nb оценивается как 95–99% от максимума в каждом из представленных экспериментов.

Рис. 6.

Определение значений k из путем замещения Nbs, связанных с меченым ATTO655 периплазматическим мутантом LacY 32C без встроенного остатка Trp. Стрелка указывает на добавление 6-12-кратного избытка Nb9063 к самому LacY (самая нижняя линия) или к комплексам LacY/Nb (семь линий с указанными Nbs). Скорость тушения флуоресценции в результате связывания Nb9063 (110 нМ) с меченым ATTO655 LacY (20 нМ) оценивалась как 0,13 с -1 (самая нижняя линия).Добавление 110–240 нМ Nb9063 к 20 нМ LacY в комплексе с указанными Nbs приводило к связыванию Nb9063 за счет высвобождения связанного Nb из комплекса LacY/Nb. Скорости тушения, оцененные по одноэкспоненциальной подгонке (черные линии), сообщают о скоростях диссоциации отдельных Nbs ( k от ) и варьировались от 7 × 10 -4 до 1,7 × 10 -2 с -1 ( Таблица 1).

Таблица 1.

Константы скорости диссоциации ( k от ), измеренные как скорость вытеснения Nbs, связанных с ATTO655-меченым 32C LacY

Обсуждение WT LacY для стабилизации конформеров с открытой периплазматической полостью, судя по повышенной доступности сайта связывания сахара для галактозидов (15).

Таким образом, скорость связывания NPG резко возрастает в комплексах WT LacY с различными Nbs (значения k на возрастают от 5 до 50 раз), демонстрируя различное увеличение доступности сайта связывания для сахара. Данные, вероятно, отражают стабилизацию различных открытых наружу конформеров LacY, которые представляют собой физиологические интермедиаты транспортного цикла. Сайт-направленный, зависящий от расстояния метод Trp-индуцированного тушения флуоресценции (16) в настоящее время используется для определения глобальных конформационных состояний этих стабилизированных комплексов LacY/Nb.Три мутанта с парами Cys-Trp либо на цитоплазматической, либо на периплазматической стороне LacY были сконструированы, помечены тиол-реактивным флуорофором и протестированы на изменение флуоресценции после взаимодействия с каждым из восьми Nbs. Наблюдается нетушение флуоресценции периплазматических и тушение цитоплазматических меченных флуорофорами пар, что свидетельствует об открытии периплазматической полости с одновременным закрытием цитоплазматической полости. Одноэкспоненциальная аппроксимация временных характеристик (рис. 2 и 4) указывает на то, что наблюдаемое изменение флуоресценции, вызванное каждым Nb, представляет собой одностадийный процесс.Кроме того, оцененные скорости изменения флуоресценции представляют скорости связывания Nb (см. значения k на и k на в таблице 1) и намного медленнее, чем скорости конформационных изменений, вызванных связыванием субстрата (17). Следовательно, Nbs не вызывают конформационных изменений в LacY. Скорее, они стабилизируют естественные интермедиаты путем конформационного отбора молекул LacY с доступными эпитопами Nb.

Закрытие цитоплазматической полости наблюдается как тушение флуорофоров в комплексах LacY/Nb.Таким образом, каждый из восьми Nbs, связывающихся с периплазматической стороной LacY (15), индуцирует изменения на цитоплазматической стороне молекулы, находящиеся на противоположной стороне молекулы на расстоянии 50–60 Å (рис. 2). Это тушение явно представляет собой уменьшение расстояния между Trp и флуорофором, потому что никаких изменений в окружающей среде вокруг флуорофоров не обнаружено при связывании Nbs (рис. S4 и S5). Практически идентичные результаты получены как с bimane, так и с ATTO655, которые отличаются структурно в соответствии с представлением о том, что индуцированное Trp тушение флуоресценции напрямую зависит от расстояния, как показано для лизоцима, меченного разными флуорофорами (16).Кроме того, степень закрытия специфична для каждого Nb с отчетливым паттерном при сравнении четырех наборов данных с тремя парами Cys-Trp и флуорофорами разного размера (рис. 3). Nbs 9063 и 9048 стабилизируют конформеры LacY с наибольшим тушением, тогда как Nbs 9047, 9033, 9043 и 9065 проявляют меньший эффект. Следовательно, оказывается, что разные Nbs улавливают структурно разные цитоплазматически замкнутые конформеры.

Хотя прямое тушение флуорофоров на цитоплазматической стороне Trp в Nb, связанном с периплазматической стороной, не может происходить из-за чрезмерно больших расстояний (17), периплазматическое расположение зонда флуорофора во многих случаях приводит к комбинированным эффектам – одновременное тушение флуорофора с помощью Trp в Nb (рис. 4 D–F , незакрашенные синие столбики и рис. S7) и усиление флуоресценции (негашение) из-за открытия полости (рис. 4 D–F , красные столбцы). Например, все Nbs гасят биман, присоединенный к Cys42, так что данные, полученные с парой 42C/378W, представляют собой комбинацию двух эффектов (рис. 4 E ). Тем не менее, общее негашение флуорофоров во всех трех периплазматических парах согласуется с увеличением расстояния и указывает на открытие полости в разной степени в зависимости от конкретного Nb (рис.4).

На периплазматической стороне наиболее четкие результаты наблюдаются у пары 32C/245W, расположенной примерно в середине периплазматической поверхности, поскольку все Nb (кроме Nb9063) не являются тушителями биман-меченого 32C (рис. 4). D , открытые синие полосы). Степень растушевки бимана постепенно снижается в комплексах LacY с Nbs 9047, 9065, 9033, 9036 и 9055 (красные столбцы на рис. 5 B ), указывая на то, что раскрытие периплазматической полости наибольшее с Nb9047 и наименьшее с Nb9055. Примечательно, что различная степень открытия периплазмы, наблюдаемая здесь, сравнима с доступностью сайта связывания сахара в WT LacY со связанными Nbs, полученной из кинетических исследований (15). Скорость связывания NPG с WT LacY выше в комплексах с Nbs 9047, 9065 или 9033 ( k на значениях 7, 9 или 8 мкМ -1 ⋅с -1 соответственно) и медленнее в комплексах с Nbs 9036 или 9055 ( k на значениях 1 или 1,2 мкМ -1 ⋅s -1 соответственно), что указывает на более высокую доступность сахара, когда связаны первые три Nbs, и более низкую доступность, когда последние два Nbs связаны.

Связывание сахара с комплексами LacY/Nb приводит к дальнейшему открытию периплазматической полости, что выявляется дополнительным негашением периплазматическими парами (рис. 5 и рис. S8 и S9). Добавленный сахар связывается с периплазматической стороны, поскольку была задокументирована повышенная доступность сахара с этой стороны в комплексах LacY/Nb (15). Следовательно, дополнительное размораживание объясняется дальнейшим раскрытием периплазматической полости после связывания сахаров. Следующее событие, закрытие периплазматической полости, предотвращается связанным Nb.Таким образом, каждый Nb стабилизирует два интермедиата, один без связанного сахара, а другой со связанным сахаром и более открытой периплазматической полостью.

Наконец, делается вывод, что кинетические определения доступности сайта связывания сахара и прямые измерения изменений расстояния в комплексах LacY/Nb показывают сходные результаты в отношении взаимодействий Nbs с LacY. Оба типа измерений дают данные, которые согласуются с выводом о том, что связывание различных Nbs стабилизирует обращенные наружу конформеры с разной степенью раскрытия полостей.Эти конформеры, вероятно, представляют собой физиологические промежуточные продукты в общем транспортном цикле. Также сообщалось, что созревшие in vivo Nbs не генерируют ненативных конформаций антигенов (19). Это представление полностью согласуется с наблюдениями, что Nbs связываются только с конформерами, в которых периплазматическая полость открыта. Таким образом, Nbs не изменяют активно конформацию LacY, а связываются только со специфическими конформерами и тем самым захватывают переходные состояния высокодинамичной молекулы LacY.

Методы

Производство Nbs, конструирование мутантов, очистка LacY и материалы, использованные в этом исследовании, описаны в SI Methods .

Мечение мутантов LacY флуорофорами.

Очищенные мутанты LacY с указанными заменами Cys (50–100 мкМ белка в 50 мМ NaP i /0,02% ДДМ, рН 7,5) смешивали с (2-пиридил)дитиобиманом (ФДТ-биман) в молярном соотношении 1:1. , или с 1,2-1,5-кратным молярным избытком АТТО655-малеимида, и инкубировали при комнатной температуре в темноте (10 мин с ФДТ-биманом или 30 мин с АТТО655-малеимидом). TDG (30 мМ) также был включен для мечения остатков Cys, введенных на периплазматической стороне, для увеличения вероятности открытия периплазматической полости, а также для защиты нативного Cys148 от мечения.Замена Cys на цитоплазматической стороне легкодоступна без связанного сахара; поэтому Cys148 был заменен на Met (C148M LacY обладает активностью WT и сродством к связыванию сахаров), и мечение проводили без TDG. Меченые образцы дважды промывали в одном и том же буфере без TDG или флуорофоров с использованием концентратора Amicon Ultra с отсечкой 50 кДа (Millipore), замораживали в жидком азоте и перед использованием хранили при температуре -80 °C.

Измерения флуоресценции.

Стационарные эмиссионные спектры флуоресценции были получены при комнатной температуре на спектрофлуориметре SPEX Fluorolog 3 (Edison) в 2.Кювета на 5 мл (1 × 1 см) в 50 мМ NaP i /0,02% ДДМ (pH 7,5), как описано (20), с возбуждением при 380 нм (для бимана) и 650 нм (для ATTO655). Динамику изменения флуоресценции регистрировали при длинах волн возбуждения/испускания 380/465 нм и 660/677 нм для биман- и ATTO655-меченого белка соответственно. Белок, меченный флуорофором (80–100 нМ), смешивали с трехкратным избытком Nb и 0,1 мМ NPG или 6 мМ TDG, как указано. Одно экспоненциальное уравнение использовалось для подбора данных, собранных в масштабе времени, который был достаточно длительным, чтобы наблюдать завершение процесса. Величину изменения флуоресценции выражали как изменение интенсивности относительно исходного уровня до данного добавления (Δ F / F 0 , %). Как правило, расчетные стандартные отклонения находились в пределах 10% от каждого представленного значения. В экспериментах по замещению меченный ATTO655 32C LacY (20 нМ) предварительно инкубировали с небольшим избытком Nb и 0,1 мМ NPG, затем добавляли 6-12-кратный избыток второго Nb, который связывается при диссоциации первого Nb. . Скорости диссоциации оценивали по временным изменениям флуоресценции путем подгонки к одноэкспоненциальному уравнению.

Методы SI

Материалы.

Олигонуклеотиды были синтезированы компанией Integrated DNA Technologies. Ферменты рестрикции были приобретены у New England Biolabs. Комплект QuikChange II был приобретен у Stratagene. β-d-галактопиранозил-1-тио-β-d-галактопиранозид (TDG) был получен от Carbosynth Limited, 4-нитрофенил-α-d-галактопиранозид (NPG) и ATTO655-малеимид были получены от Sigma, а (2-пиридил) дитиобиман (ФДТ-биман) был приобретен в компании Toronto Research Biochemicals. Смола Talon superflow была приобретена у BD Clontech. Додецил-β-d-мальтопиранозид (DDM) был получен от Anatrace. Все остальные материалы имели квалификацию «х. ч.», полученную из коммерческих источников.

Производство Nbs.

Nbs были приготовлены против периплазматического открытого мутанта G46W/G262W LacY, встроенного в протеолипосомы, с использованием опубликованного протокола (19), как описано (15), с получением растворимых белков с His- и Capture Select C-мечеными (молекулярная масса ∼15 кДа) в периплазме Escherichia coli WK6.Индуцируемая периплазматическая экспрессия Nbs дает чистоту нанотел >95% с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов (смола Talon) периплазматического экстракта бактерий. Очищенные Nbs (2–10 мг/мл) в 100 мМ фосфата калия (KP i , pH 7,5) замораживали в жидком азоте и перед использованием хранили при -80 °C.

Создание мутантов и очистка LacY.

Конструирование мутантов, экспрессию в E. coli и очистку LacY проводили, как описано (8).Периплазматические пары Cys-Trp вводили на фоне LacY WT, содержащем восемь нативных остатков Cys и шесть остатков Trp. Мутанты с цитоплазматическими парами Cys-Trp содержали дополнительную замену C148M. Все мутанты содержали С-концевую 6His-метку, которую использовали для аффинной очистки со смолой Talon. Очищенные белки (10–15 мг/мл) в 50 мМ фосфате натрия (NaP и /0,02% ДДМ, рН 7,5) замораживали в жидком азоте и хранили при –80 °С до использования.

Гомологическое моделирование структур Nb.

Моделирование трехмерных структур Nbs было выполнено на веб-сервере SWISS-MODEL с использованием в качестве шаблона рентгеновской структуры гельзолинового нанотела (идентификационный код PDB 2X1P), который имеет ~70% идентичность последовательности с LacY — производные нанотела.

Благодарности

Благодарим Джуничи Сугихару за умелую техническую помощь в подготовке мутантов LacY. Эта работа была поддержана грантом NIH DK51131 и грантом Eager Grant 1547801 Национального научного фонда (HRK).

Сноски

  • Вклад авторов: I.С., В.К. и Х.Р.К. проектное исследование; ЯВЛЯЕТСЯ. и В.К. проведенное исследование; И.С., В.К., X.J., Е.П. и Дж.С. предоставил новые реагенты/аналитические инструменты; И.С., В.К., Х.Р.К. проанализированные данные; и И.С., В.К., и Х.Р.К. написал бумагу.

  • Рецензенты: P.E.K., Университет штата Канзас; и CM, Медицинский институт Говарда Хьюза, Университет Брандейса.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1519485112/-/DCSupplemental.

Изучение вклада механизмов активной защиты в толерантность к ципрофлоксацину у Escherichia coli, растущего с разной скоростью Escherichia coli

K-12 внутрирамочные мутанты с нокаутом одного гена: коллекция Keio. Мол Сист Биол 2:1–11. https://doi.org/10.1038/msb4100050

Статья КАС Google Scholar

  • Bailey AM, Webber MA, Piddock LJV (2006) Среда играет роль в определении экспрессии acrB , marA и soxS в Escherichia coli . Противомикробные агенты Chemother 50:1071–1074. https://doi.org/10.1128/AAC.50.3.1071-1074.2006

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Belenky P, Ye JD, Porter CBM, Cohen NR, Lobritz MA, Ferrante T, Jain S, Korry BJ, Schwarz EG, Walker GC, Collins JJ (2015) Бактерицидные антибиотики вызывают токсические метаболические нарушения, которые приводят к повреждению клеток . Сотовый представитель 13: 968–980. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.09.059

    Артикул пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Brantl S, Jahn N (2015) мРНК в бактериальных системах токсин-антитоксин типа I и типа III. FEMS Microbiol 39: 413–442. https://doi.org/10.1093/femsre/fuv003

    Статья КАС Google Scholar

  • Буш Н.Г., Диез-Сантос И., Эббот Л.Р., Максвелл А. (2020) Хинолоны: механизм, летальность и их вклад в устойчивость к антибиотикам. Молекулы 25:5662. https://doi.org/10.3390/molecules25235662

    Статья ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Carlioz A, Touati D (1986) Выделение мутантов супероксиддисмутазы в Escherichia coli : необходима ли супероксиддисмутаза для аэробной жизни? EMBO 5:623–630

    Артикул КАС Google Scholar

  • Compan I, Touati D (1993) Взаимодействие шести глобальных регуляторов транскрипции в экспрессии супероксиддисмутазы марганца в Escherichia coli K-12.J Bacteriol 175: 1687–1696. https://doi.org/10.1128/jb.175.6.1687-1696.1993

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Dörr T, Vulic M, Lewis K (2010) Ципрофлоксацин вызывает образование персистеров, индуцируя токсин TisB в Escherichia coli . PLoS Биол 8:e1000317. https://doi.org/10.1371/journal. pbio.1000317

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Drlica K, Malik M, Kerns RJ, Zhao X (2008) Хинолонопосредованная бактериальная смерть.Противомикробные агенты Chemother 52: 385–392. https://doi.org/10.1128/AAC.01617-06

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Durfee T, Hansen AM, Zhi H, Blattner FR, Ding JJ (2008) Профилирование транскрипции строгого ответа в Escherichia coli . Дж. Бактериол 190:1084–1096. https://doi.org/10.1128/JB.01092-07

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Dwyer DJ, Kohanski MA, Hayete B, Collins JJ (2007) Ингибиторы гиразы индуцируют окислительное повреждение пути гибели клеток у Escherichia coli .Мол Сис Биол 3:91. https://doi.org/10.1038/msb4100135

    Статья КАС Google Scholar

  • Dwyer DJ, Camacho DM, Kohanski MA, Callura JM, Collins JJ (2012) Вызванная антибиотиками гибель бактериальных клеток демонстрирует физиологические и биохимические признаки апоптоза. Мол Ячейка 46: 561–572. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2012.04.027

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Двайер Д.Д., Беленький П.А., Ян Д.Х., Макдональд И.С., Мартелл Д.Д., Такахаши Н., Чан CTY, Лобриц М.А., Брафф Д., Шварц Э.Г., Йе Д.Д., Пати М., Веркруйсс М., Ралифо П.С., Эллисон К.Р., Халил AS, Ting AY, Walker GC, Collins JJ (2014) Антибиотики вызывают окислительно-восстановительные физиологические изменения как часть их летальности.Proc Natl Acad Sci USA 111: E2100–E2109. https://doi.org/10.1073/pnas.1401876111

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Eng RHK, Padberg FT, Smith SM, Tan EN, Cherubin CE (1991) Бактерицидное действие антибиотиков на медленно растущие и нерастущие бактерии. Противомикробные агенты Chemother 35: 1824–1828. https://doi.org/10.1128/aac.35.9.1824

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Эрентал А. , Кальдерон З., Саада А., Смит Ю., Энгельберг-Кулка Х. (2014) Смерть, подобная апоптозу, крайняя реакция SOS у Escherichia coli .Мбио. https://doi.org/10.1128/mBio.01426-14

    Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Ezraty B, Vergnes A, Banzhaf M, Duverger Y, Huguenot A, Brochado AR, Su SY, Espinosa L, Loiseau L, Py B, Typas A, Barras F (2013) Кластерный биосинтез Fe-S контролирует поглощение аминогликозиды в пути смерти без АФК. Наука 340: 1583–1587. https://doi.org/10.1126/science.1238328

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Fung DKC, Chan EWC, Chin ML, Chan RCY (2010) Определение сети реакции бактериального голодания на стресс, которая может способствовать развитию толерантности к антибиотикам.Противомикробные агенты Chemother 54: 1082–1093. https://doi.org/10.1128/AAC.01218-09

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Goormaghtigh F, Van Melderen L (2019) Визуализация отдельных клеток и характеристика персистентных клеток Escherichia coli к офлоксацину в экспоненциальных культурах. Научная реклама https://doi.org/10.1126/sciadv.aav9462

    Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Госвами М., Манголи С.Х., Джавали Н. (2006) Участие активных форм кислорода в действии ципрофлоксацина на Escherichia coli .Противомикробные агенты Chemother 50:949–954. https://doi.org/10.1128/AAC.50.3.949-954.2006

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Госвами М., Субраманиан М., Кумар Р., Ясс Дж., Джавали Н. (2016) Участие механизма оттока антибиотиков в опосредованном глутатионом снижении активности ципрофлоксацина в Escherichia coli . Противомикробные агенты Chemother 60:4369–4374. https://doi.org/10.1128/AAC.00414-16

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Greulich P, Scott M, Evans MR, Allen RJ (2015) Зависимая от роста бактериальная восприимчивость к антибиотикам, нацеленным на рибосомы. Мол Сист Биол 11:796. https://doi.org/10.15252/msb.20145949

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Hengge R (2008) Двухкомпонентная сеть и сигма-фактор общего стресса RpoS (σ S ) в Escherichia coli . Adv Exp Med Biol 631:40–53. https://doi.org/10.1007/978-0-387-78885-2_4

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Hirai K, Aoyama H, Irikura T, Iyobe S, Mitsuhashi S (1986) Различия в чувствительности к хинолонам мутантов внешней мембраны Salmonella typhimurium и Escherichia coli .Противомикробные агенты Chemother 29: 535–538. https://doi.org/10.1128/aac.29.3.535

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Hong Y, Li Q, Gao Q, Xie J, Huang H, Drlica K, Zhao X (2020) Активные формы кислорода играют доминирующую роль во всех путях быстрого уничтожения, опосредованного хинолонами. J Antimicrob Chemother 75: 576–585. https://doi.org/10.1093/jac/dkz485

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Ihssen J, Egli T (2004) Конкретная скорость роста, а не плотность клеток контролируют общую реакцию на стресс у Escherichia coli .Микробиология 150: 1637–1648. https://doi.org/10.1099/mic.0.26849-0

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Imlay JA (2013) Молекулярные механизмы и физиологические последствия окислительного стресса: уроки модельной бактерии. Nature Rev Microbiol 11: 443–454. https://doi.org/10.1038/nrmicro3032

    Статья КАС Google Scholar

  • Imlay JA (2015) Диагностика окислительного стресса у бактерий: не так просто, как вы думаете.Curr Opin Microbiol 24:124–131. https://doi.org/10.1016/j.mib.2015.01.004

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Иванова А. , Миллер С., Глинский Г., Эйзенстарк А. (1994) Роль rpoS ( katF ) в независимой регуляции oxyR гидропероксидазы I в Escherichia coli . Мол микробиол 12: 571–578. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1994.tb01043.х

    Артикул пабмед КАС Google Scholar

  • Камартхапу В., Эпштейн В., Бенджамин Б., Прошкин С., Миронов А., Кашел М., Нудлер Э. (2016) ppGpp связывает транскрипцию с репарацией ДНК в E. coli . Наука 352: 993–996. https://doi.org/10.1126/science.aad6945

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Керен И., Ву И., Иносенсио Дж., Малкахи Л.Р., Льюис К. (2013)Уничтожение бактерицидными антибиотиками не зависит от активных форм кислорода.Наука 339: 1213–1216. https://doi.org/10.1126/science.1232688

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Кохански М. А., Дуайер Д.Дж., Хайете Б., Лоуренс К.А., Коллинз Дж.Дж. (2007)Общий механизм гибели клеток, вызванный бактерицидными антибиотиками. Ячейка 130: 797–810. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.06.049

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Коршунов С., Имлей Дж. А. (2006) Обнаружение и количественная оценка супероксида, образующегося в периплазме Escherichia coli .Дж. Бактериол 188:6326–6334. https://doi.org/10.1128/JB.00554-06

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Lee AJ, Wang S, Meredith HR, Zhuang B, Dai Z, You L (2018) Надежная линейная корреляция между скоростью роста и скоростью β-лактам-опосредованного лизиса. Proc Natl Acad Sci USA 115:4069–4074. https://doi.org/10.1073/pnas.1719504115

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Leonardo MR, Dailly Y, Clark DP (1996) Роль NAD в регуляции гена adhE в Escherichia coli . Дж. Бактериол 178:6013–6018. https://doi.org/10.1128/jb.178.20.6013-6018.1996

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Lewin CS, Morrissey I, Smith JT (1991) Механизм действия хинолонов: парадокс в активности низких и высоких концентраций и активности в анаэробной среде. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 10:240–248

    Статья КАС Google Scholar

  • Liu Y, Imlay JA (2013) Гибель клеток от антибиотиков без участия активных форм кислорода.Наука 339: 1210–1213. https://doi.org/10.1126/science.1232751

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Lobritz MA, Belenky P, Porter CBM, Gutierrez A, Yang JH, Schwarz EG, Dwyer DJ, Khalil AS, Collins JJ (2015) Эффективность антибиотиков связана с бактериальным клеточным дыханием. Proc Natl Acad Sci USA 112:8173–8180

    Статья КАС Google Scholar

  • Масловска К. Х., Макиела-Дзбенска К., Фиялковска И.Ю. (2019) Система SOS: сложный и строго регулируемый ответ на повреждение ДНК.Environ Mol Mutagen 60: 368–384. https://doi.org/10.1002/em.22267

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Миллер Дж. Х. (1972) Эксперименты по молекулярной генетике. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк

    Google Scholar

  • Миронов А., Серегина Т., Нагорных М., Лухачак Л.Г., Королькова Н., Лопес Л.Е., Котова В., Завилгельский Г., Шакулов Р., Шаталин К., Нудлер Е. окислительный стресс у Escherichia coli .Proc Natl Acad Sci USA 114:6022–6027. https://doi.org/10.1073/pnas.1703576114

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Mulvey MR, Switala J, Boris A, Loewen PC (1990) Регуляция транскрипции katE и katF в Escherichia coli . J Bacteriol 172:6713–6720

    Статья КАС Google Scholar

  • Myka KK, Küsters K, Washburn R, Gottesman ME (2019)Взаимодействия DksA-РНК-полимеразы поддерживают образование нового происхождения и восстановление ДНК в Escherichia coli .Мол микробиол 111:1382–1397. https://doi.org/10.1111/mmi.14227

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Navarro Llorens JM, Tormo A, Martinez-Garcia E (2010)Стационарная фаза грамотрицательных бактерий. FEMS Microbiol Rev 34: 476–495. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2010.00213.x

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Park S, Imlay JA (2003) Высокие уровни внутриклеточного цистеина способствуют окислительному повреждению ДНК, вызывая реакцию Фентона.Дж. Бактериол 185:1942–1950. https://doi.org/10.1128/JB.185.6.1942-1950.2003

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Pontes MH, Groisman EA (2019) Медленный рост определяет ненаследуемую устойчивость к антибиотикам у Salmonella enterica . Научный сигнал. https://doi.org/10.1126/scisignal.aax3938

    Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Pontes MH, Groisman EA (2020) Физиологическая основа ненаследуемой устойчивости к антибиотикам.Мбио. https://doi.org/10.1128/mBio.00817-20

    Статья пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

  • Potrykus K, Murphy H, Philippe N, Cashel M (2011) ppGpp является основным источником контроля скорости роста E. coli . Environ Microbiol 13: 563–575. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2010.02357.x

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Rand JD, Danby SG, Greenway DL, England RR (2002) Повышенная экспрессия генов множественного оттока лекарств acrAB происходит во время медленного роста Escherichia coli .FEMS Microbiol Lett 207:91–95

    Статья КАС Google Scholar

  • Seaver LC, Imlay JA (2001) Алкилгидропероксидредуктаза является основным поглотителем эндогенной перекиси водорода в Escherichia coli . Дж. Бактериол 183:7173–7181. https://doi.org/10.1128/JB.183.24.7173-7181.2001

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Шаталин К., Шаталина Е., Миронов А., Нудлер Е. (2011) H 2 S: Универсальная защита бактерий от антибиотиков.Наука 334: 986–990. https://doi.org/10.1126/science.1209855

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Sies H (2017)Перекись водорода как центральная окислительно-восстановительная сигнальная молекула при физиологическом окислительном стрессе: окислительный эустресс. Окислительно-восстановительный биол 11: 613–619. https://doi.org/10.1016/j.redox.2016.12.035

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. (2005) Глутатион в биохимии бактерий (Москва) 70:1199–1211.https://doi.org/10.1007/s10541-005-0248-3

    Статья КАС Google Scholar

  • Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. (2018) Взаимосвязь между скоростью роста Escherichia coli и чувствительностью бактерий к ципрофлоксацину. FEMS Microbiol Lett. https://doi.org/10.1093/femsle/fnx254.10.1093/femsle/fnx254

    Статья пабмед Google Scholar

  • Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховченко М.Н., Октябрьский О.Н. (2000) Влияние менадиона и перекиси водорода на статус глутатиона при выращивании Escherichia coli .Free Radic Biol Med 28: 1009–1016. https://doi.org/10.1016/s0891-5849(99)00256-7

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Смирнова Г., Музыка Н., Октябрьский О. (2012) Трансмембранный цикл глутатиона при выращивании клеток Escherichia coli . Microbiol Res 167: 166–172. https://doi.org/10.1016/j.micres.2011.05.005

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Ушаков В.Ю., Тюленев А.В., Октябрьский О.Н. (2015) Внеклеточный супероксид провоцирует выход глутатиона из клеток Escherichia coli .Res Microbiol 166: 609–617. https://doi.org/10.1016/j.resmic.2015.07.007

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Смирнова Г., Музыка Н., Лепехина Е. (2016) Октябрьский О. (2016) Роль глутатион- и тиоредоксин-зависимых систем в реакциях Escherichia coli на ципрофлоксацин и ампициллин. Arch Microbiol 198: 913–921. https://doi.org/10.1007/s00203-016-1247-z

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Смирнова Г.В., Тюленев А.В., Музыка Н.Г., Петерс М.А., Октябрьский О.Н. (2017) Ципрофлоксацин провоцирует SOS-зависимые изменения дыхания и мембранного потенциала и вызывает изменения редокс-статуса Escherichia coli .Res Microbiol 168: 64–73. https://doi.org/10.1016/j.resmic.2016.07.008

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Смирнова Г.В., Тюленев А.В., Безматерных К.В., Музыка Н.Г., Ушаков В.Ю., Октябрьский О.Н. (2019) Гомеостаз цистеина при ингибировании синтеза белка в клетках Escherichia coli . Аминокислоты 51: 1577–1592. https://doi.org/10.1007/s00726-019-02795-2

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Steinchen W, Bange G (2016) Волшебный танец алармонов (p)ppGpp.Мол Микробиол 101:531–544

    Артикул КАС Google Scholar

  • Суфья Н., Эллисон Д.Г., Гилберт П. (2003) Клональные вариации максимальной удельной скорости роста и восприимчивости к противомикробным препаратам. J Appl Microbiol 95:1261–1267. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2003.02079.x

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Tao K, Makino K, Yonei S, Nacata A, Shinagawa H (1989) Молекулярное клонирование и секвенирование нуклеотидов oxyR , положительного регуляторного гена регулона для адаптивного ответа на окислительный стресс у Escherichia coli : гомологии между белком OxyR и семейством белков-активаторов бактерий.Мол Ген Жене 218: 371–376. https://doi.org/10.1007/bf00332397

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Theodore A, Lewis K, Vulic M (2013) Толерантность Escherichia coli к фторхинолоновым антибиотикам зависит от конкретных компонентов пути SOS-реакции. Генетика 195: 1265–1276. https://doi.org/10.1534/genetics.113.152306

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Tietze F (1969) Ферментативный метод количественного определения количества нанограммов общего и окисленного глутатиона: приложения к крови млекопитающих и другим тканям.Анальная биохимия 27: 502–522. https://doi.org/10.1016/0003-2697(69)

    -5

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Tuomanen E, Cozens R, Tosch W, Zak O, Tomasz A (1986) Скорость уничтожения Escherichia coli β-лактамными антибиотиками строго пропорциональна скорости роста бактерий. J Gen Microbiol 132: 1297–1304. https://doi.org/10.1099/00221287-132-5-1297

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Тюленев А., Смирнова Г., Музыка Н., Ушаков В., Октябрьский О. (2018) Роль сульфидов в стресс-индуцированных изменениях Eh в культурах Escherichia coli .Биоэлектрохимия 121:11–17. https://doi.org/10.1016/j.bioelechem.2017.12.012

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Van Acker H, Coenye T (2017) Роль активных форм кислорода в уничтожении бактерий антибиотиками. Тенденции микробиол 25:456–466. https://doi.org/10.1016/j.tim.2016.12.008

    Статья пабмед КАС Google Scholar

  • Volkert MR, Gately FH, Hajec LI (1989) Экспрессия генов, индуцирующих повреждение ДНК Escherichia coli , при обработке метилирующими, этилирующими и пропилирующими агентами.Мутация Res 217:109–115

    Статья КАС Google Scholar

  • Weisemann JM, Weinstock GM (1988) Мутации в цистеиновых кодонах гена recA Escherichia coli . ДНК 7:389–398

    Статья КАС Google Scholar

  • Wickens HJ, Pinney RJ, Mason DJ, Gant VA (2000) Проточно-цитометрическое исследование филаментации, проходимости мембран и мембранного потенциала в Escherichia coli после воздействия ципрофлоксацина.Противомикробные агенты Chemother 44: 682–687. https://doi.org/10.1128/AAC.44.3.682-687.2000

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Yang JH, Bening SC, Collins JJ (2017) Эффективность антибиотиков – контекст имеет значение. Curr Opin Microbiol 39: 73–80. https://doi.org/10.1016/j.mib.2017.09.002

    Статья пабмед ПабМед Центральный КАС Google Scholar

  • Справочник персонала

     Валерия Речинос

    Комната К-2

     

    Коллин Мейджорс

    Только английский Первый класс

    Комната 5

     

    Хумьера Баргзи

    Английский только второй класс

    Комната 15

    Код

    .орг

     

    Либанет Саенс

    Двуязычный третий класс

    Комната 20

     

     

    Бет Ким

    Билингв Четвертый класс

    Комната 29

     

     

    Найма Армента

    Только английский, пятый класс

    Комната 26

     

    Вероника Лено Гарсия

    Двуязычный детский сад

    Комната К1

    Меган Брэмхолл

    Двуязычный первый класс

    Комната 6

    Эрлинда Хатами

    Двуязычный второй класс

    Комната 16

    Кристин Боттинг

    Двуязычный третий класс

    Комната 21

     

     

     

    Мария Арреола

    Двуязычный четвертый класс

    Комната 30

     

     

     

    Жасмин Мейер

    Билингв Пятый класс

    Комната 23

     

    Мариола Гарсия

    Двуязычный комбо ТК/К

    Комната К-3

     

    Патрисия Бенавидес

    Двуязычный первый класс

    Комната 2

     

     

    Стейси Флуршейм

    Комбинированный класс 1/2

    Комната 14

     

     

     

     

    Тереза ​​Стрэттон  

    Только английский Третий класс

    Комната 22

    Код

    .орг

     

     

     

    Кейтлин Мерлетти

    Только английский язык, четвертый класс

    Комната 32

    Code.org

     

     

    Нора Руан

    Только английский, пятый класс

    Комната 25

    Code.org

     

     

     

     

     

     

     

     

    Келли Дрейк

    Двуязычный второй класс

    Комната 17 

     

     

     

    Девин Эзаки

    Только английский, четвертый/пятый набор

    Комната 19

     

     

     

     

     

     

     

     

    Россия завоевала первую золотую медаль в парном могуле фристайл

    Вусала Аббасова 12 марта 2021 г.

    Смирнова сохраняла чистоту и плавность на протяжении всего забега и завоевала золотую медаль с итоговым результатом 83.08 очков, став третьим самым молодым чемпионом мира в истории лыжного могула. / Ханс Пеннинк / Фото AP

    Россия впервые в своей истории завоевала золото чемпионата мира в двойном могуле среди женщин благодаря впечатляющему выступлению российской лыжницы-фристайлистки Анастасии Смирновой на чемпионате мира FIS по фристайлу 2021 года по лыжному фристайлу и сноуборду.

    Во вторник 18-летняя лыжница-фристайлистка, представляющая Федерацию лыжного спорта России, заработала свое первое золото чемпионата мира за лучший результат в своей стремительно набирающей популярность карьере, обогнав в финале свою подругу по команде Викторию Лазаренко и казахстанку Анастасию Городько. Это была вторая медаль, завоеванная Смирновой за два дня. В понедельник она завоевала бронзу в женском магнате.

    Смирнова сохраняла чистоту и гладкость на протяжении всего забега, чтобы завоевать золотую медаль с итоговым результатом 83.08 очков, став третьим самым молодым чемпионом мира в истории лыжного могула. Тем временем 17-летняя Лазаренко, с невероятной скоростью пронесшаяся по алматинской трассе, завоевала серебряную медаль с результатом 84,51 балла, допустив пару ошибок в поворотах на среднем участке.

    Соревнуясь со средним уклоном склона 26 градусов на дистанции от 660 до 890 футов (примерно от 200 до 270 метров), лыжник-могол получает баллы за скорость, технику поворота и два обязательных вертикальных прыжка.Курсы могула включают в себя два небольших трамплина, которые используются в качестве взлетной площадки для воздушных маневров. Спортсмены могут выполнять вертикальные или перевернутые трюки с этих прыжков в ходе соревновательного забега.

    Чемпионат мира FIS по фристайлу и сноуборду 2021 года проводится в ряде стран, а именно в Швеции (Идре), Словении (Рогла), Казахстане (Алматы) и США (Аспен). Могуловая часть чемпионата мира FIS по фристайлу 2021 года прошла в Алматы, крупнейшем городе и бывшей столице Казахстана, с 8 по 11 марта.Алматы принял участие в соревнованиях по акробатике и могулу после того, как Чжанцзякоу отказался от участия в соревнованиях из-за ограничений, введенных Китаем в связи с Covid-19.

    В этом году спортсмены и сборная страны выступают под флагом Олимпийского комитета России (ОКР) и Федерации лыжного спорта России (РФР) по решению Всемирного антидопингового агентства (ВАДА), запретившего крупнейшему в Каспийском регионе страны от всех крупных спортивных мероприятий. Четырехлетний запрет за предполагаемую фальсификацию данных московской лаборатории запрещает России участвовать в Олимпийских играх 2020 года в Токио в этом году, чемпионате мира по футболу в Катаре 2022 года и зимних Олимпийских играх 2022 года в Пекине.

    .